【摘要】： 目的:心脑血管疾病已成为威胁人类生命的重要疾病之一。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)的增生和迁移,是许多心脑血管疾病发生的重要因素之一。Rho/Rho激酶介导的信号转导通路参与了众多血管生理功能的调节,如细胞骨架重组,平滑肌收缩,细胞增生、黏附、迁移以及其他炎症反应过程,而这些细胞功能又与许多血管疾病的发生发展密切相关[1]。 ROCK即Rho激酶,广泛存在于各种组织中,有两种同源异构体ROCK-Ⅰ,ROCK-Ⅱ。Rho激酶在多种组织器官的平滑肌收缩中起作用[2]。Rho激酶被Rho蛋白激活后,对下游肌球蛋白进行磷酸化,使胞浆中的肌球蛋白轻链磷酸化水平增加,进一步使肌动蛋白和肌球蛋白交联增加,从而使肌动蛋白微丝骨架聚合,引起肌动-肌球蛋白收缩,最终引起VSMC迁移。阐明Rho激酶与血管平滑肌细胞的迁移的分子机制,将为许多心脑血管疾病的研究和治疗提供重要的理论依据[3,4]。 本研究拟采用RNA干扰技术,对ROCK-Ⅰ基因表达进行下调,研究ROCK-Ⅰ基因与血管平滑肌细胞迁移的关系。为进一步研究Rho激酶与血管平滑肌细胞迁移的分子机制提供实验依据。 方法:根据大鼠ROCK-Ⅰ基因参考序列设计合成siRNA,通过实验筛选出有效的siRNA,然后通过脂质体将ROCK-Ⅰ的siRNA转入A7r5细胞,对于转染后的细胞进行如下实验:1.提取细胞的总RNA,然后做逆转录PCR,在基因水平上检测ROCK-Ⅰ基因表达下调的情况;2.提取细胞总蛋白,通过蛋白印迹技术,在蛋白水平上检测ROCK-Ⅰ基因表达下调情况;3.用Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验,测定ROCK-Ⅰ基因表达下调前后细胞迁移率的影响。 结果: 1. siRNA转染效率实验 运用带有荧光标记的siRNA分别转染细胞(5h、24h、48h、72h),在荧光显微镜下观察细胞的转染效率,并进行细胞计数和统计分析。每组时间段做4个平行孔,实验重复3次。结果显示:转染效率分别为77.8%、85.2%、83.3%和85.7%。siRNA 5h即可被成功地转染到细胞中,以48或72小时的转染效果最佳。 2.脂质体毒性实验 用不同浓度的脂质体(分别为0、0.56ng/μl、0.83ng/μl、1.67ng/μl)进行转染,在不同的时间段(24h、48h、72h)收集细胞并进行细胞计数,计算出不同浓度脂质体在不同时间段的细胞死亡率,结合上述siRNA转染效率实验,确定siRNA转染效率最高时脂质体的浓度和最佳的转染时间。最终确定脂质体最佳浓度为0.56ng/μl~0.83ng/μl。 3.在基因水平上的检测: 转染48h和72h后,分别提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,在基因水平上检测RNA干扰前后ROCK-Ⅰ表达量的变化。研究显示siRNA转染后ROCK-Ⅰ表达量与对照组相比明显下降(P=0.012)。 4.在蛋白水平上的检测ROCK-Ⅰ表达: 运用免疫印迹技术,检测转染72h后细胞中ROCK-Ⅰ表达量的变化。实验结果显示:转染组细胞中ROCK-Ⅰ蛋白的表达量比对照组明显降低(P=0.022)。 5. PDGF-BB诱导血管平滑肌细胞(A7r5)迁移: 利用血小板源性生长因子BB二聚体(PDGF-BB)作为诱导剂诱导细胞迁移,用Boyden微孔膜双槽法检测细胞迁移。实验结果显示,PDGF-BB在低浓度时,诱导剂与细胞迁移数量存在剂量依赖关系,随着浓度的增加,细胞迁移的数量增加。当PDGF-BB达到5ng/ml时,随着诱导剂浓度的增加,细胞迁移的数量下降。因此,得出PDGF-BB的最佳诱导浓度为5ng/ml。 6. ROCK-Ⅰ基因表达下调对血管平滑肌细胞(A7r5)迁移的影响: 用5ng/ml PDGF-BB诱导剂,以Boyden微孔膜双槽法建立的细胞迁移的模型,观察不同剂量的siRNA对平滑肌细胞(A7r5)迁移的影响。实验组与对照组分别设置6个平行孔。显微镜下观察到细胞迁移数量随着siRNA剂量的增加而呈减少的趋势,表明ROCK-Ⅰ基因表达下调可以抑制血管平滑肌细胞(A7r5)的迁移,实验组与对照组相比经统计学分析有显著差异(P=0.000)。 结论:通过RNA干扰方法成功地使ROCK-Ⅰ的基因表达下调,证实ROCK-Ⅰ基因表达的下调可以抑制血管平滑肌细胞的迁移。这些研究为进一步探讨ROCK-Ⅰ与血管平滑肌细胞迁移的分子机制提供了实验依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346
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6 潘q，
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