大鼠骨髓间充质干细胞生物反应器灌注培养细胞数量即时监测与分化的研究

发布时间：2018-12-27 06:45

【摘要】：目的:骨髓中存在一定数量的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem ce11s,MSCs),这些细胞具有自我复制能力,在特定的诱导条件下能够分化为骨、软骨和脂肪等。将骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞等,为修复重建由于创伤、感染、肿瘤等各种组织缺损,提供了理想的治疗手段,是一项非常具有应用前景的技术。但是目前实验室的培养规模,很难满足临床上对种子细胞数量的需求,迫切需要在生物反应器上进行规模化的生产,而在生物反应器上的规模化生产,对细胞的数量即时监测存在着很大的挑战。本实验通过自制一套小规模灌注培养扩增的反应器系统,在该生物反应器上进行连续灌注培养骨髓间充质干细胞,通过监测进出培养T瓶的培养液中的葡萄糖及乳酸即时浓度,CCK-8法测定该生物反应器T瓶中的即时细胞数量,寻找他们之间的一种数学关系,通过监测葡萄糖或乳酸浓度间接监测到生物反应器中细胞数量。并对在该生物反应器上连续灌注培养后的细胞分化能力进行测定,比较与静态培养的间充质干细胞的分化能力有无明显的差异。实验方法:1.采用贴壁筛选法分离、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况。 2. CCK-8法测定细胞数量,并作出细胞生长曲线。 3.向生长状态良好的P3代静态培养细胞及灌注培养后的间充质干细胞中加入成骨细胞诱导液(α-MEM培养液,15%胎牛血清,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8M地塞米松,50μg/ml抗坏血酸)培养两周。两周后进行碱性磷酸酶活性测定,碱性磷酸酶染色和茜素红染色。 4.当P3静态培养及灌注培养后的骨髓间充质干细胞达到完全融合时,加入脂肪细胞诱导液(1μg/ml胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L的IBMX及15%FBS的α-MEM),逐日观察细胞变化,两周后油红O染色鉴定。 5.在24孔板上接种2×104cells/ml的间充质干细胞3ml,静态培养,每3天换一次液,收集到的废液在Nova Bioprofile 100+上检测其葡萄糖、乳酸浓度,并对换液中的一组细胞进行消化,CCK-8计数。通过计算出葡萄糖消耗率、乳酸累计率及细胞数量,做出拟合曲线。 6.生物反应器上培养T瓶的6×104cells/ml接种15ml,静态培养3天后,开启蠕动泵进行灌注培养,连续灌注20天,每五天检测一次废液中葡萄糖、乳酸浓度,CCK-8计量细胞数。通过计算出葡萄糖消耗率、乳酸累计率及细胞数量,做出拟合曲线。试验结果:1.大鼠骨髓间充质干细胞的形态学观察:骨髓间充质干细胞接种后24h开始贴壁,随着时间的延长贴壁细胞数量明显增加,呈现梭形或多角形形态,经换液逐步将培养瓶中不贴壁的细胞清除;接种后4-5d可见较明显的集落形成,集落的形态、大小、密度各不相同;约6-8d,贴壁细胞逐渐融合成单层,细胞多呈梭形,细胞排列呈现明显的辐射状、漩涡状。 2.定向诱导为成骨细胞:在诱导3-4d后,骨髓间充质干细胞逐渐变得扁平,由细长梭形转变为三角形或多角形;8d时,培养细胞大部分变为多角形,细胞外基质分泌增多;第14d时,培养细胞之间出现黑色结节样结构。ALP活性较高,ALP和茜素红染色大多数细胞成阳性。灌注培养后细胞与静态培养细胞在成骨分化能力上没有明显差异。 3.定向诱导成脂肪细胞:在成脂肪诱导5d,细胞原来的多角形突触逐渐回缩,但仍呈多角形;7-8d时出现明显脂滴,脂滴多位于细胞边缘;诱导14d后,脂肪细胞增加,细胞内脂滴密布,多数细胞形态变圆,多散在分布。油红0染色大部分细胞呈阳性。灌注培养后细胞与静态培养细胞在成脂分化能力上没有明显差异。 4.实验细胞数量范围内,24孔板静态培养的间充质干细胞数量与葡萄糖的消耗率成线性关系(R2=0.9684)葡萄糖的比细胞得率qG lu=1.84mg /106cells-d;24孔板静态培养的间充质干细胞数量与乳酸累计率( R2=0.9571),乳酸的比细胞得率q Lac=1.736mg /106cells-d 5.实验细胞数量范围内,生物反应器灌注培养T瓶中骨髓间充质干细胞数量可认为与葡萄糖的消耗率成线性关系(R2=0.9664)qG lu=1.66 mg/106cells-day;干细胞数量与乳酸累计率成线性关系(R2=0.9554) q Lac=1.61mg/106 cells-day。 2.大鼠骨髓间充质干细胞在Dex、β-甘油磷酸钠和维C作用下,可以向成骨细胞分化。灌注培养扩增的间充质干细胞和静态培养的干细胞一样具有相同成骨分化能力。 3.大鼠骨髓基质干细胞在胰岛素、Dex和IBMX诱导下,可以定向分化为脂肪细胞。灌注培养扩增的间充质干细胞和静态培养的干细胞具有相同成脂分化能力。 4.大鼠骨髓间充质干细胞在自制生物反应器中进行扩增,实验细胞数量范围内,葡萄糖消耗率、乳酸累计率与细胞数量成线性关系。
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【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】