tmTNF-α启动TNFR2凋亡信号转导的研究

发布时间：2019-01-02 20:58

【摘要】：肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),是一个多功能的细胞因子,参与各种不同的细胞活动,其中包括诱导其他细胞因子的产生,细胞的增殖、分化和凋亡。TNF-α首先被合成26 kDa的膜结合因子(跨膜肿瘤坏死因子-α,transmembraneTNF-alpha,tmTNF-α),在金属蛋白酶或其他酶类的作用下,从细胞膜外表面被剪切为17 kDa的可溶性分子(分泌型肿瘤坏死因子-α,secreted TNF-alpha,sTNF-α)。两型TNF-α以不同亲和力与TNFR1和TNFR2结合而发挥生物学功能。细胞骨架蛋白Actin已经被发现在多种信号传导通路中起着重要的调节作用,其中包括sTNF-α介导的细胞死亡。但是,Actin是否参与tmTNF-α介导的细胞胞毒作用尚不清楚。本实验室首次发现tmTNF-α在杀伤靶细胞HL-60的时候,可和Actin发生免疫共沉淀。故本研究的上篇以HL-60为靶细胞,探讨tmTNF-α杀伤信号和靶细胞骨架蛋白Actin之间的关系。此外,tmTNF-α如何启动TNFR2凋亡信号转导途径也尚未见报道,本研究下篇以HepG2细胞为模型,研究tmTNF-α诱导TNFR2凋亡信号复合物的形成,为干预临床肿瘤探寻新的分子靶点。上篇骨架蛋白Actin参与tmTNF-α杀伤信号的研究主要实验结果如下: 一.CytD对Actin聚合的影响:在不同的时间点使用非中毒剂量的CytD(2μM)来处理HL-60细胞,激光共聚焦图像显示,在对照组细胞中,Actin主要分布于细胞核周围以及细胞膜下。但是随着CytD作用时间的延长,Actin明显分散于细胞胞浆中,且细胞荧光强度高于对照组细胞。二.CytD预先作用靶细胞时间对tmTNF-α杀伤作用的影响:采用MTT方法检测发现,tmTNF-的细胞胞毒作用随着CytD预处理时间的延长而降低。在CytD预作用120min时,其对Actin的聚合和tmTNF-α介导的细胞胞毒作用的抑制强度最大,故后续实验均采用2μM CytD预处理2小时。使用特异性抗体中和tmTNF-α的作用,完全抑制了这种膜分子的细胞毒效应。三.Actin解聚抑制了tmTNF-α介导的细胞凋亡:采用AnnexinV-PI方法检测发现,与对照组细胞相比,HL-60细胞对sTNF-α介导的细胞胞毒作用是抵抗的,但却对tmTNF-α介导的细胞凋亡很敏感,凋亡率约50%。反之,用CytD使Actin解聚,可明显抑制降低HL-60细胞对tmTNF-α的敏感性。这些数据充分表明Actin与tmTNF-α介导的细胞毒作用密切相关。四.TNFR 1和TNFR2抗体交叉反应的鉴定:采用Western方法检测发现,抗TNFR1的单克隆抗体只能检测到人sTNFR1和HL-60细胞中的TNFR1,而抗TNFR2的单克隆抗体只能检测到人sTNFR2和HL-60细胞中的TNFR2。提示这两种抗TNFR1和抗TNFR2的单克隆抗体不存在交叉反应,可以用于后续的免疫共沉淀实验。五.Actin解聚影响TNF-α介导的信号转导: 1.对TNFR1信号转导的影响:采用免疫共沉淀方法检测发现,与对照组相比,经Actin解聚后,sTNF-α刺激使TNFR1上募集的SODD明显减少;而其它各处理组TNFR1上募集的SODD无明显改变。tmTNF-α和sTNF-α可明显促进TNFR1募集TRAF1和RIP1,用CytD解聚Actin后无明显变化。 2.对TNFR2信号转导的影响:采用免疫共沉淀方法检测发现TNFR2不能募集SODD;tmTNF-α可明显促进TNFR2募集RIP1,却抑制TRAF1的募集;而sTNF-α则反之,促进TNFR2募集TRAF1,却抑制RIP分子向TNFR2的聚集。用CytD解聚Actin,则逆转tmTNF-α的信号,促进TNFR2募集TRAF1,却抑制RIP1向TNFR2的聚集;Actin解聚同样抑制sTNF-α诱导的TRAF1募集,但对RIP1则无影响。上述结果提示Actin参与两型TNF-α不同的信号通路,且主要与TNFR2相关。六.tmTNF-α介导的TNFR2与Actin的相互作用可以被CytD阻断:采用免疫共沉淀方法检测证实,Actin可少量与TNFR1发生免疫共沉淀,且各处理因素对之无影响。相反,tmTNF-α可明显增加Actin与TNFR2共沉淀的量,然而,用CytD促进Actin解聚则完全阻断了tmTNF-α诱导的Actin与TNFR2的结合。提示Actin主要通过TNFR2而不是TNFR1来参与tmTNF-α介导的调亡信号转导途径。七.Actin解聚对TNF及其受体表达的影响:采用FCM检测证实,CytD的预处理导致该细胞TNFR2表达明显降低,但对TNFR1的表达却并无影响。由于Actin解聚对细胞裂解物中TNFR2的总量并无影响,提示Actin可能影响TNFR2转位至细胞表面,而并不影响它的合成。同时,用CytD进行预处理可导致细胞表面tmTNF-α表达明显增加。八.Actin解聚阻断tmTNF-α诱导的TRAF2与TNFR2的解离:采用免疫共沉淀方法检测发现,tmTNF-α的刺激使TRAF2与TNFR2结合减少,但CytD的预处理可完全阻断tmTNF-α的这种作用,反而促进TNFR2对TRAF2分子的募集。激光共聚焦图像显示,无论有无tmTNF-α,Actin都分布在细胞膜下以及细胞核周围的细胞胞浆中,且TRAF2在胞浆中呈弥散分布。相反,CytD导致Actin弥散性分布,并促进tmTNF-α刺激的细胞中TRAF2从胞浆向胞膜转位。然而,单独使用CytD却不能导致TRAF2的转位。提示Actin的动态结构可以促进tmTNF-α导致的TRAF2与TNFR2的解离。九.Actin解聚抑制tmTNF-α诱导的TNFR2对RIP1的募集:采用免疫共沉淀方法检测发现,tmTNF-α促进TNFR2复合物对RIP1的募集。相反,CytD可完全阻断tmTNF-α介导的RIP1向TNFR2的募集。激光共聚焦图像显示,tmTNF-α诱导RIP1从胞浆到胞膜的转位以及RIP1与聚集的Actin共定位。然而,CytD解聚Actin,导致RIP1弥散分布在细胞胞浆中。这些结果显示Actin的动态结构促进了tmTNF-α诱导的TNFR2复合物对RIP1的募集。十.Actin的解聚逆转了tmTNF-α诱导的NF-κB失活:采用Western方法检测显示,tmTNF-α使细胞胞浆中IκB-α的水平升高,提示IκB-α组成性降解受到tmTNF-α的抑制。然而,CytD预处理则阻断tmTNF-α的抑制作用。采用ELISA方法检测显示,tmTNF-α显著地抑制HL-60细胞中NF-κB组成性活化,而CyotD则封闭了tmTNF-α的这一效应,并恢复了NF-κB的活性。此外,CytD单独处理对于NF-κB的活性并无影响。十一.Actin解聚阻断tmTNF-α诱导的Caspase-8活化及其对RIP1的剪切: 1.在TNFR2介导的细胞凋亡中Caspase-8活性的变化:采用Western方法检测显示,在tmTNF-α刺激下,Caspase-8的激活最早在3h被观察到,在12 h最为明显。 2.Actin解聚对tmTNF-α诱导Caspase-8活化及其RIP1剪切的影响:采用Western方法检测显示,tmTNF-α激活的Caspase-8能剪切RIP1。与此相反的是,CytD预处理明显抑制了tmTNF-α对Caspase-8的激活,并因此降低了后者对RIP1的剪切。 3.Z-IETD-FMK对tmTNF-α诱导Caspase-8活化及其RIP1剪切的影响:采用Western方法检测显示,Caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK能完全阻断tmTNF-α诱导的Caspase-8的活化及其对RIP1的剪切。 4.Z-IETD-FMK对tmTNF-α介导的细胞凋亡的影响:采用Western方法和MTT方法检测显示,Z-IETD-FMK能完全封闭了tmTNF-α抑制IκB-α降解及其介导的杀伤效应。十二.Actin解聚阻断tmTNF-α抑制cFLIP的表达及其募集: 1.Actin解聚对tmTNF-α抑制cFLIP向TNFR2募集的影响:采用免疫共沉淀方法检测显示,tmTNF-α的刺激减少了TNFR2和cFLIP的结合。与此相反,CytD预处理完全封闭了tmTNF-α的这种作用,并使cFLIP与TNFR2结合增加。 2.Actin解聚对tmTNF-α抑制cFLIP表达的影响:采用Western方法检测显示,cFLIP的表达在tmTNF-α刺激12 h后几乎完全被抑制,而CytD则完全阻断了tmTNF-α的这种作用,并使cFLIP的表达恢复到基础水平。下篇tmTNF-α诱导TNFR2凋亡信号转导的研究主要实验结果如下: 一.九株肿瘤细胞表面tmTNF-α与TNFR的表达:采用FCM方法检测结果显示,HeLa细胞株以表达TNFR1为主,K562、Raji和HepG2细胞株则以表达TNFR2为主,而1号MCF-7、T24和239细胞株的tmTNF-α和TNFR表达率均较低且无明显差异,3号MCF-7细胞株的tmTNF-α和TNFR表达率均较高且无明显差异。二.Caspase抑制剂对tmTNF-α介导的细胞凋亡的影响:采用MTT方法检测结果显示,caspase的泛抑制剂Z-VAD-FMK可使tmTNF-α对2号MCF-7、HeLa、HepG2和T24细胞株的胞毒作用受到明显抑制;但是,该抑制剂对tmTNF-α杀伤3号MCF-7细胞株则无明显影响。提示tmTNF-α的杀伤作用尽管需要依赖caspase,但是也可通过caspase非依赖性途径杀伤靶细胞。三.tmTNF-α介导的细胞凋亡中Caspase-8和Caspase-3的活化 1.tmTNF-α介导的MCF-7细胞凋亡中caspase的表达:采用western方法检测结果显示,用tmTNF-α刺激MCF-7细胞,Caspase-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的含量无明显变化。 2.tmTNF-α介导的HeLa细胞凋亡中caspase的活化:采用western方法检测结果显示,用tmTNF-α刺激以表达TNFR1为主的HeLa细胞,Caspase-8最早在6 h被剪切活化,且随刺激时间延长,其活化逐渐增加。同时,Caspase-3含量也逐渐减少。其它各caspase含量基本无明显变化。 3.tmTNF-α介导的HepG2细胞凋亡中caspase的活化:采用western方法检测结果显示,用tmTNF-α刺激以表达TNFR2为主的HepG2细胞,Caspase-8最早在24 h时被剪切。同时,Caspase-3含量也逐渐减少。其它各caspase含量基本无明显变化。 4.tmTNF-α介导的T24细胞凋亡中caspase的活化:采用western方法检测结果显示,随着tmTNF-α刺激时间的延长,T24细胞株中的Caspase-8最早在6 h时被剪切,其活化逐渐增加。同时,Caspase-3含量也逐渐减少。其它各caspase含量基本无明显变化。上述结果提示tmTNF-α介导的细胞凋亡与Caspase-8和Caspase-3相关。TNFR表达类型的差异,可能影响Caspase-8活化的时间。以下我们选用表达TNFR2为主的HepG2进行实验。四.两型TNF-α对HepG2细胞的胞毒作用:采用MTT方法检测结果证实,tmTNF-α可有效杀伤靶细胞,其诱导的凋亡率约40%;但是,sTNF-α对HepG2细胞无杀伤作用。用放线菌素D可部分增加HepG2细胞对sTNF-α介导的胞毒作用的敏感性。这些数据充分表明两型TNF-α对同一靶细胞可诱导不同的生物学效应。五.tmTNF-α作用12 h对HepG2细胞凋亡的影响:采用PI染色方法检测结果证实,刺激12 h后tmTNF-α介导的细胞凋亡率约为50%,而HepG2细胞则明显抵抗sTNF-α的杀伤效应。这些数据充分表明两型TNF-α介导的细胞凋亡存在明显差异。六.两型TNF-α对HepG2细胞周期的影响:采用PI染色方法检测结果显示,刺激12 h后tmTNF-α组出现明显的亚G1峰,同时G1期的细胞约减少了40%,提示tmTNF-α主要诱导G1期细胞凋亡。而sTNF-α则导致S期细胞量增加。七.tmTNF-α通过TNFR2募集促凋亡信号分子:采用免疫共沉淀方法检测结果显示,刺激15 min时tmTNF-α刺激TNFR2募集FADD、RIP1和Caspase-8;刺激25 min时tmTNF-α刺激TNFR2仅募集FADD和RIP1。相反,sTNF-α则完全抑制TNFR2对上述分子的募集。同时,我们未检测出TNFR2对TRADD的募集。八.tmTNF-α抑制TNFR2募集抗凋亡信号分子:采用免疫共沉淀方法检测结果显示,tmTNF-α抑制了TNFR2对TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2、和cFLIP的募集。相反,sTNF-α则增强了TNFR2对这六个信号分子的募集。同时,sTNF-α可能通过TRAF2将NIK招募到TNFR2复合物中,而tmTNF-α则无此作用。九.tmTNF-α介导NF-κB的失活与sTNF-α介导NF-κB的活化:采用ELISA方法检测结果发现,tmTNF-α引起HepG2细胞组成性活化的NF-κB受到显著性抑制,而sTNF-α则可使NF-κB进一步活化。综上所述,两型TNF-α启动HepG2细胞的TNR2信号通路不同,tmTNF-α主要诱导TNFR2凋亡信号复合物(FADD/RIP1/Caspase-8)形成,而sTNF-α则主要诱导TNFR2抗凋亡信号复合物(TRAF1-3/clAP1-2/cFLIP)形成,进而分别导致靶细胞凋亡或存活。此外,Actin主要参与tmTNF-α启动TNFR2的凋亡信号通路,即促进TNFR2募集RIP1,导致TRAF2和cFLIP与TNFR2的解离,从而促进Caspase-8活化及其对RIP1的剪切,进而导致NF-κB失活,并通过caspase级联系统介导tmTNF-α的致凋亡效应。该研究不但为深入阐明两型TNF-α的生物学特征提供实验依据,而且为临床抗肿瘤治疗提供新的分子靶点和干预线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R341

【参考文献】