空肠弯曲菌鞭毛输出系统关键基因flhA突变株的构建及其功能的初步研究

发布时间：2019-01-05 14:05

【摘要】：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)为微需氧、无芽孢的革兰氏阴性弯曲短杆菌,是全球范围内人类感染性腹泻常见的食源性病原菌。鞭毛不仅是其运动器官,更是主要的毒力因子,在C. jejuni黏附、定殖、侵入肠上皮细胞以及毒力蛋白分泌外输过程中起重要作用。鞭毛输出系统是鞭毛合成、装配以及功能表现重要的结构基础,大部分研究认为鞭毛输出系统与革兰氏阴性细菌的Ⅲ型毒力蛋白分泌系统在进化上是同源的,基因组分析以及相关的实验研究初步显示,鞭毛输出系统很可能承担了C. jejuniⅢ型毒力蛋白的转运功能,与C. jejuni鞭毛致病性密切有关。 为了深入探索鞭毛输出系统与鞭毛合成以及致病性关联的分子机制,本课题运用分子生物学手段构建了C. jejuni鞭毛输出系统关键基因flhA突变株(HXW001),并初步研究了flhA在毒力和分子调控方面的功能。 1、flhA插入失活突变株HXW001的构建与鉴定 本研究使用插入失活的方法构建空肠弯曲菌flhA突变株,首先在E.coil JM109中构建敲除载体pMD19-T-flhA-kanr。其次,使用电转化的方法将其导入到空肠弯曲菌中,利用同源重组获得突变株HXW001。 2、突变株致病相关表型的初步研究 主要包括生长性能、运动能力、菌体结构、自身凝集性(Autoagglutination)、菌膜形成能力等,初步解析C. jejuni flhA与毒力的相关性。结果表明,flhA的缺失,对菌体的生长性能并无明显影响,但是HXW001菌株的鞭毛缺失且丧失运动能力,生物膜形成能力和自身凝集现象明显下降,说明flhA是鞭毛结构和致病性重要的分子基础。 3、flhA对鞭毛合成调节功能的初步研究 通过荧光定量PCR的方法研究了flhA对主要鞭毛丝蛋白基因flaA、调节基因fliA(σ28)和rpoN (σ54)在转录水平上的调节功能,结果显示,flhA的缺失降低了鞭毛结构基因flaA和鞭毛合成第三级调节基因fliA的转录,对鞭毛合成第二级调节基因rpoN并无明显的影响,表明flhA不仅与鞭毛蛋白输出有关,而且对鞭毛丝蛋白及其调节因子具有转录水平的调控能力。 4、flhA与Ⅲ型毒力蛋白胞内表达和胞外分泌相关性初步研究 首先通过荧光定量PCR的方法研究了flhA对Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB在胞内转录水平的影响,结果表明,flhA并不影响Ⅲ型毒力蛋白基因ciaB的胞内转录水平。其次研究了flhA对Ⅲ型毒力蛋白胞外分泌能力的影响,构建ciaB原核表达系统,并且制备和纯化了CiaB蛋白,用于制备CiaB的多克隆抗体,便于今后运用Western blot的方法定性观察flhA突变株HXW001与野生型在CiaB蛋白分泌能力上的差异程度。
[Abstract]:Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni) is a gram-negative short bacillus with microaerobic and no spores. It is a common foodborne pathogen of human infectious diarrhea worldwide. Flagella is not only its motor organ, but also the main virulence factor, which plays an important role in the adhesion, colonization, invasion of intestinal epithelial cells and secretion of virulence protein. The flagellum output system is an important structural basis for flagellum synthesis, assembly and functional expression. Most studies suggest that the flagellum output system is evolutionarily homologous to the type 鈪，

本文编号：2401862