金属硫蛋白对丁烯酸内酯致氧化损伤的保护作用

发布时间：2019-01-30 08:49

【摘要】： 丁烯酸内酯(Butenolide,BUT)是由镰刀菌属产生的一种水溶性镰刀菌毒素,其多侵染与生产、生活密切相关的农作物,对人类健康是一种潜在的危害。研究认为,克山病和大骨节病的病因可能与镰刀菌毒素对粮食的污染有关,而BUT是病区粮食中较常见的镰刀菌毒素。以往的实验证实,肝脏和心脏是BUT的主要靶器官之一,BUT在体内、体外均可引起动物肝组织明显的脂质过氧化效应,还可通过对心肌细胞及心肌匀浆明显的脂质过氧化作用而诱导心肌氧化损伤。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类存在于细胞内的低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,其在哺乳动物器官中有4种异构形式:MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。MT-Ⅰ/Ⅱ是MT最主要的异构形式。MT在机体拮抗有害重金属毒性、清除自由基、抗氧化应激、抗凋亡和参与细胞生长调节等方面均发挥重要作用。大量研究显示,MT可明显抑制自由基引起的氧化损伤。目前,有关MT对BUT所致氧化损伤的保护作用未见报道。我们利用两种不同MT表达水平的动物—MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除(MT-/-)小鼠与相应的野生型(MT+/+)小鼠,考察体内MT表达对BUT所致肝组织氧化损伤的影响。研究认为,BUT中毒可能与地方性心肌病—克山病的发病有关,因此本研究以原代培养的MT+/+小鼠及MT-/-小鼠心肌细胞为研究对象,从氧化应激的角度进一步探讨BUT对心肌的损伤作用,并考察MT对BUT致心肌细胞的毒性是否具有保护作用,并初步探讨其作用机制。本课题将有助于进一步揭示氧化损伤在BUT毒性中的作用,对有效防治BUT的健康危害具有重要的理论与实践意义。 1金属硫蛋白对丁烯酸内酯致小鼠肝脏氧化损伤的保护作用既往研究显示,肝脏是BUT的重要靶器官。本研究利用体外染毒的方式研究MT对BUT所致肝脏氧化损伤的保护作用。将MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织匀浆与不同浓度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,测定肝组织匀浆中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量。实验结果显示,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织MDA含量增加,呈明显的剂量-效应关系,与对照组相比具有显著性差异(P0.01)。MT+/+小鼠与MT-/-小鼠的对比研究显示,在无BUT作用时,MT+/+小鼠与MT-/-小鼠肝组织匀浆中MDA含量没有明显差异。在BUT作用剂量50-200μg/ml时,两种动物肝组织中的MDA含量存在显著性差异,MT-/-小鼠肝匀浆中的MDA明显高于同一剂量下的MT+/+小鼠,且随着作用剂量的增加,两者的差异更为显著。200μg/ml染毒组MT-/-小鼠肝匀浆中MDA的含量是MT+/+小鼠的1.4倍。由此表明,MT-/-小鼠肝脏MDA的生成显著大于MT+/+小鼠,MT-/-小鼠肝脏氧化损伤比MT+/+小鼠更为显著。我们还观察了BUT作用的时效关系。将MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织匀浆与100μg/ml BUT共同孵育,分别在0、0.5、1、2、4 h五个时间点检测肝组织MDA含量。结果显示,在0-2 h间,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织MDA含量增加,呈明显的时间-效应关系;随染毒时间延长至4 h,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织MDA含量均下降,各剂量组与对照组相比均具有显著性差异(P0.05)。MT+/+小鼠与MT-/-小鼠的对比研究显示,在无BUT作用时,MT+/+小鼠与MT-/-小鼠肝组织匀浆中MDA含量没有明显差异。BUT作用0.5、1、2和4 h后,MT-/-小鼠肝组织MDA含量分别是MT+/+小鼠的1.5、1.42、1.62和1.64倍。由此表明,随着BUT染毒时间的延长,MT-/-小鼠肝脏MDA的生成显著大于MT+/+小鼠。通过测定肝组织中主要抗氧化物酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性,以及总巯基(TSH)和非蛋白巯基(NPSH)、一氧化氮(NO)的含量,进一步考察MT对BUT致肝脏氧化损伤的保护作用。将MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝脏组织匀浆与不同浓度的BUT(0-200μg/ml)共同孵育1 h,测定各项指标。结果表明,BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织主要抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低。在未经毒素处理的情况下,MT+/+小鼠与MT-/-小鼠肝组织GSH-Px活性就存在一定的差异,MT-/-小鼠肝组织GSH-Px活性高于MT+/+小鼠。为消除两种小鼠基础值不同所带来的差异,我们利用归一化百分率的方法进行两种动物的比较,结果显示,MT-/-小鼠肝组织GSH-Px活性在50、100和200μg/ml剂量时显著低于MT+/+小鼠(P0.01),200μg/ml染毒组MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝组织GSH-Px的活力分别下降了30%和70%,MT+/+小鼠肝组织GSH-Px的活性是MT-/-小鼠的2.33倍;在25μg/ml至200μg/ml各染毒组中,MT-/-小鼠肝组织SOD活力均显著低于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒组MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝组织SOD的活力分别下降了13%和21%。由此说明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性明显低于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织总巯基(TSH)、非蛋白巯基(NPSH)含量降低,呈明显剂量-效应关系,且与对照组比较均具有显著性差异(P0.01),其中以NPSH变化最为明显。在200μg/ml染毒组中,MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织NPSH含量分别下降了95.2%和97.6%。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的对比研究显示,MT+/+小鼠与MT-/-小鼠肝组织匀浆中总巯基含量没有明显差异,NPSH含量存在显著性差异,200μg/ml染毒组MT+/+小鼠肝组织NPSH剩余含量是MT-/-小鼠的2.23倍。由此说明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝组织NPSH的消耗明显多于MT+/+小鼠。 BUT可致MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝组织NO含量增高,100和200μg/ml染毒组与对照组比较差异均具有显著性(P0.01)。MT+/+小鼠及MT-/-小鼠的对比研究显示,MT-/-小鼠肝组织NO含量在100、200μg/ml剂量时显著高于MT+/+小鼠(P0.05),200μg/ml染毒组MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肝组织NO含量分别升高了2.6倍和4.6倍,MT-/-小鼠肝组织NO含量约是MT+/+小鼠的1.8倍。由此说明,在BUT作用下,MT-/-小鼠肝组织NO的产生明显多于MT+/+小鼠。综上所述,BUT通过抑制MT+/+小鼠及MT-/-小鼠肝脏组织中主要抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性、降低组织中抗氧化物质巯基(TSH和NPSH)的含量、破坏体内抗氧化系统的平衡、使体内自由基清除减少脂质过氧化物的分解产物(MDA)大量蓄积,从而引起肝组织明显的氧化损伤。说明MT基因敲除后,肝组织内MT缺乏,抗氧化系统清除能力降低,自由基以及脂质过氧化产物含量增高。MT可增强体内抗氧化酶活力,降低非蛋白巯基的损耗,清除自由基,减少脂质过氧化产物MDA的累积,其对BUT所致脂质过氧化效应具有保护作用。 2金属硫蛋白对丁烯酸内酯致小鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用前期研究显示,BUT能引起心肌细胞明显的脂质过氧化作用,但其机制尚未阐明。本研究采用原代培养的MT+/+和MT-/-小鼠心肌细胞,进一步研究BUT致心肌细胞氧化损伤的机理,并考察MT对BUT致心肌细胞损伤的保护作用。主要从以下几个方面对BUT的细胞毒性及MT的保护作用进行评价:细胞形态、细胞存活率、活性氧产生、DNA损伤等。实验结果表明,BUT对心肌细胞有明显的毒性作用,其对心肌细胞的损伤在形态上主要表现为:细胞水肿、空泡样变性、肌纤维断裂、核固缩、凝固性坏死等。BUT能够浓度和时间依赖性地降低细胞存活率,且呈现明显的量效和时效关系,两种小鼠心肌细胞的相对存活率的对比研究显示,随着剂量的增加,两种小鼠心肌细胞的相对存活率存在显著性差异(P0.01),MT-/-小鼠心肌细胞细胞存活率明显低于MT+/+小鼠,说明MT对BUT致小鼠心肌细胞毒性作用有明显的抑制作用。BUT作用心肌细胞不同时间,MT+/+和MT-/-小鼠心肌细胞培养液中LDH漏出与对照组相比较均无显著性差异。为进一步阐明BUT致心肌细胞损伤的机理以及MT的保护作用,本研究利用荧光探针标记方法检测细胞内ROS生成。通过单细胞凝胶电泳实验,检测心肌细胞DNA的损伤情况。结果显示BUT能够明显增加MT+/+和MT-/-小鼠心肌细胞内ROS的产生,两种小鼠心肌细胞ROS的产生存在差异(P0.05),MT-/-小鼠心肌细胞ROS的产生明显高于MT+/+小鼠;单细胞凝胶电泳实验发现,随着BUT剂量的逐渐增大,MT+/+和MT-/-小鼠心肌细胞DNA损伤不断增加。综合细胞内ROS生成检测结果可说明随着BUT剂量的不断增大,细胞内抗氧化系统不能及时清除细胞内ROS,从而造成心肌细胞DNA损伤。通过对两种小鼠心肌细胞的尾部DNA百分含量,尾长,尾矩等指标进行分析发现,MT-/-小鼠心肌细胞DNA损伤程度大于MT+/+小鼠。由此表明,BUT可诱导细胞内氧化性物质ROS的过量产生,从而引起细胞内明显的氧化应激,导致细胞内DNA的损伤;而MT通过抑制心肌细胞ROS的产生,减轻心肌细胞DNA损伤,提高心肌细胞的存活率,对BUT所致心肌细胞的毒性作用有着很好的保护作用。综上所述,BUT可诱导肝脏、心肌细胞明显的氧化损伤,而MT通过抑制自由基的产生,增强体内抗氧化能力,从而对BUT所致的氧化损伤具有很好的保护作用。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363

【参考文献】