内皮细胞STIM1在钙库排空后其细胞内的分布变化

发布时间：2019-01-30 09:45

【摘要】：Ca~(2+)作为细胞内重要的第二信使，有着重要的生物学效应。其中，钙库控制的钙内流（Store-operated Ca~(2+) entry，SOCE）是非兴奋性细胞钙离子内流的主要机制，其有着重要的生物学意义，参与体内许多生理反应：细胞内钙库的充盈，酶类的激活，基因的表达，细胞活素类的释放等。近几年的研究发现，STIM1（stromal interaction molecule 1），即基质交感分子1，在SOCE中起到很重要的作用。 STIM1最先是由于其肿瘤抑制作用被人们所关注，其在免疫缺陷病及多类肿瘤中起着重要作用，但是新近的研究发现STIM1对细胞钙离子内流的调控起着至关重要的作用。 STIM1是一种存在于内质网上的跨膜蛋白，含有几个保守的且重要的结构域：位于内质网腔的EF-hand和sterile a motif（SAM）,测序表明，从蠕虫到蝶类再到人类EF-hand和SAM是很保守的结构域；位于胞浆中的卷曲螺旋区和脯氨酸，赖氨酸富集区。 STIM1N端的EF-hand是一钙离子感受器--可以感受ER中Ca~(2+)的变化：Ca~(2+)充盈时，EF-hand以单聚体的形式存在，这种单体有着致密的α螺旋结构；当Ca~(2+)排空时，EF- hand的紧密螺旋结构减少，促进二聚体和低聚物的形成。其它的结构域，如SAM,卷曲螺旋区和脯氨酸赖氨酸富集区在STIM1颗粒的转位及激活胞膜上的SOC通道有着至关重要的作用。 ER利用钙泵ATP酶行使摄取钙和储存钙的功能, TG，即毒胡萝卜素，是钙泵ATP酶的抑制剂，即钙库不能摄取钙并储存，能够达到钙库排空的目的。2 ER钙库充盈时，通过免疫细胞化学或是融合蛋白STIM1-YFP的过表达方法发现STIM1主要位于胞浆，其中位于内质网内的N端EF-Hand与内质网内的Ca~(2+)结合。在TG作用下，ER钙库排空时，STIM1 EF-Hand与Ca~(2+)解离，STIM1转位于胞膜下，激活胞膜上的SOC通道，从而导致Ca~(2+)内流入细胞引起一系列生理反应。 STIM1引起外钙内流入细胞的过程归纳如下：1）内质网膜上的STIM1作为Ca~(2+)感受器监测内质网钙库的排空；2）随着钙库的排空，STIM1由原来的均匀分布变成聚集分布，形成颗粒，转位至胞膜下；3）转位到胞膜下的STIM1引起胞膜上的Orai1聚集，进而激活SOC通道引起外钙内流入细胞。更具体来说，这种信号传递分为四步：1）内质网中的Ca~(2+)浓度降低使STIM1的EF-hand和Ca~(2+)解离；2）与Ca~(2+)解离后的STIM1迅速在内质网上形成低聚物；3）STIM1低聚物的C端可以指引其向胞膜方向移位；4）移位到胞膜下的STIM1颗粒激活钙通道。本实验使用细胞免疫荧光技术和Western Blot首次检测到在人脐静脉内皮细胞STIM1主要分布于胞浆，在TG作用下STIM1的分布发生转位，但是在不同的作用时间其转位也有所不同，随作用时间的增加呈振荡性分布于胞浆及细胞核膜。为了进一步验证STIM1在钙库排空后发生核转位，本实验将克隆的内皮细胞STIM1并构建共GFP融合表达的GFP-STIM1导入人脐静脉内皮细胞，通过激光共聚焦显微镜实时监测其TG刺激后的分布变化。另有报道称Jurkat T细胞在TG作用下STIM1发生胞膜转位并持续相当一段时间。那么，是什么机制导致两种细胞在TG作用下分布变化的不同呢？STIM1在核钙信号起到怎样的作用呢？这是本课题组进一步研究的内容。对于细胞核内的钙信号研究一直存在争议，本实验的深入研究将可能为细胞核内钙信号调控机制研究提供新的理论依据。目的：已有研究表明STIM1在钙库排空后移位至细胞膜可引起膜SOC通道开放促使Ca~(2+)内流。本文利用细胞免疫荧光技术和Western Blot检测在人脐静脉内皮细胞核膜或核内是否存在STIM1及在钙库排空后其转位变化，并探讨其对核钙信号的影响。方法： 1.用胰蛋白酶消化法原代培养人脐静脉内皮细胞，用胰蛋白酶消化法进行细胞传代培养。 2.采用细胞化学免疫荧光技术鉴定细胞的内皮来源。 3.细胞TG刺激后应用细胞免疫荧光技术检测STIM1的分布。 4.核浆蛋白分离提取和Western Blot检测STIM1在人脐静脉内皮细胞中的分布。 5.细胞鉴定后,利用转染技术或是病毒感染使带荧光的STIM1 cDNA在内皮细胞进行过表达。 6.用2μM的TG刺激转染或是病毒感染成功的细胞，激光共聚焦显微镜来实时监测GFP-STIM1的分布变化，分为两组：TG刺激组和TG未刺激组。结果： 1.细胞的形态以及内皮细胞八因子的特异性表达证实所培养细胞为脐静脉内皮细胞，且纯度100%。 2.未刺激前，，在人脐静脉内皮细胞中STIM1主要分布于细胞胞浆，细胞核内几乎无表达。用1μM的TG作用于人脐静脉内皮细胞，1分钟时STIM1分布变化不明显；3分钟后STIM1明显向核膜聚集；10分钟时STIM1又恢复到未刺激前的状态，即主要分布于胞浆；作用30分钟时，STIM1再次聚集于核膜；60分钟时其重新主要分布于胞浆。简而言之，随着TG作用时间延长，STIM1的分布呈振荡性的转位于胞浆与核膜。 3. Western Blot检测到在人脐静脉内皮细胞中，STIM1表达于胞浆，核内无表达。 4.通过激光共聚焦显微镜，在TG的刺激下检测到GFP-STIM1的转位变化： TG未刺激组，GFP-STIM1没有分布变化；TG刺激后，GFP-STIM1由散在均匀分布状变为颗粒状，并且向核转位。结论： 1.胰蛋白酶消化法能够成功地培养人脐静脉内皮细胞。 2.在人脐静脉内皮细胞中，STIM1主要分布于胞浆，TG刺激后，STIM1转位于核，并随TG作用时间的延长STIM1在胞浆与核膜之间来回转位。 3. GFP-STIM1在TG刺激后发生转位，进一步证实了STIM1在钙库排空后发生核转位。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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