LSB-1噬菌体水解酶重组技术及应用研究

发布时间：2019-02-11 13:37

【摘要】：2010年10月,世界多国报道了“超级细菌”(“Super- bug”,一种耐药革兰氏阴性细菌,含NDM-1耐药基因)引发感染并导致严重危害的事件。震撼全球的信息再一次将人类的目光聚焦到微生物的进化与变异、耐药与灾难,这一严峻的公共卫生问题上。近年来,伴随着耐药病原体的不断出现,抗菌药物和抗菌制剂的开发、应用面临前所未有的挑战。突破传统抗菌技术的机制,探索和建立新的抗菌技术是医学领域一项迫切的任务。噬菌体,作为细菌的病毒,能够特异性的感染和裂解细菌,其裂解宿主菌的效应和机制被研究者所关注。得益于丰富的生物特点,烈性(毒性)噬菌体形态各异,裂解宿主菌的方式多样,作用过程巧妙而独特,是新型抗菌技术和方法的重要仿生模板,将启发我们更多的创新思维。噬菌体水解酶是噬菌体的关键溶菌成分,观察和探索其结构和功能对开发和应用噬菌体生物酶有着重要意义。基于此,本研究以前期研究中筛选获得的新型噬菌体LSB-1为试验体,采用微生物学、分子生物学和生物信息学等方法对此株新型噬菌体的形态、结构、以及归类于水解酶系的唾液酸酶(endo-N)的基因及蛋白结构进行观察和分析。通过以噬菌体T7为载体的重组技术,进一步使endo-N基因得到融合、表达。相关研究内容和结果如下: 1. LSB-1噬菌体的生物性质及分子特征:通过透射电镜、一步生长曲线及核酸酶切电泳等技术对噬菌体LSB-1的生物性质和分子特征进行全面分析,确定LSB-1噬菌体有1个多面体立体对称的头部,直径大约为50±5nm,尾丝长约为60±5nm,属于短尾噬菌体科(Podoviridae)。噬菌体的5min吸附率为94.3%,潜伏期是23min,平均释放量为80个。经限制性内切酶Nhe I酶切产生2条清晰条带,表明分子量在30kb左右。 2. LSB-1噬菌体宿主识别与裂解关键酶的确定:利用Shotgun基因组测序、ORF Finder、blast、Sequin和MEGA 4等系列生物信息分析技术,完成了噬菌体全基因组测序,验证了核酸大小约为30kp(dsDNA),有15个主要的功能基因,进一步证实噬菌体了LSB-1为一株新的噬菌体;通过同源比对、系统进化树分析和功能预测并发现编码尾丝蛋白的gp17与噬菌体宿主识别及裂解功能有关,属于endo-N。 3. Endo-N的结构分析:利用SOPMA、PDB、SWISS-MODEL、PHYRE、RasMol和CN3D 4.1等信息分析技术对endo-N编码gp17基因的一级结构、二级结构和空间结构进行分析,构建了LSB-1噬菌体gp17基因的三维结构模型,并成功预测出其表面活性中心。发现其三维结构由“Domain A”和“Domain B”两个结构域构成,N末端位于结构域A,C末端位于结构域B,整个酶分子结构以β折叠为主。其蛋白表面正负电荷分布区域相差不大,整个蛋白分子表面电荷基本呈中性。其酶活性中心位于结构域A中,由Glut405,Arg415和Arg487构成活性中心。 4. Gp17基因的克隆:对endo-N的编码基因gp17进行扩增,全长基因插入原核表达载体噬菌体T7,成功构建了含gp17的T7-LSB-gp17重组噬菌体。重组噬菌体纯化后通过PCR扩增到目的基因,经DNA测序验证,结果与LSB-1噬菌体的gp17基因核苷酸序列一致,通过蛋白电泳分离出目的条带,证实T7-LSB-gp17重组噬菌体构建成功。 5.噬菌体重组前后效应观察:利用稀释、双层琼脂铺板、挑取单个噬菌斑法对T7-LSB-gp17重组噬菌体进行纯化,采用终点滴定法测得重组噬菌体滴度(pfu/ml);重组噬菌体T7-LSB-gp17对大肠杆菌E.coli 8401、E.coli 285和EHEC O157,及其它种属的金黄色葡萄球菌、腊样芽胞杆菌繁殖体和类炭疽芽胞杆菌繁殖体均有明显的溶菌效应。综上所述,本研究通过对大肠杆菌8401噬菌体LSB-1的分子特征进行分析,认识其属于短尾病毒科,30kp的dsDNA噬菌体,存在15个主要的功能基因。其中获得编码endo-N的重要功能基因gp17,结合生物信息学手段描述了endo-N的三维结构和功能预测。结合分子生物学技术,扩增gp17基因,将其插入原核表达载体噬菌体T7,重组噬菌体T7-LSB-gp17对多种大肠杆菌及其它种属的金黄色葡萄球菌、腊样芽胞杆菌繁殖体和类炭疽芽胞杆菌繁殖体均有明显的溶菌效应。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

【参考文献】