负载BMP-7基因的脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

发布时间：2019-02-13 17:23

【摘要】： 目的 脊柱融合术是目前骨科医生常用的术式之一,但融合失败率较高。目前设计的内固定器械可以保证脊柱的即刻稳定性,提供植骨融合所需的力学环境,但脊柱的长期稳定最终还要依靠骨性融合。脊柱融合术中自体骨移植通常被认为是“金标准”,但是脊柱融合需要较大的植骨量而自体骨来源有限,并且会对供体造成新的损害,常会伴有供区疼痛、神经损伤、骨折、感染等并发症。而异体骨具有免疫原性,而且存在传染疾病等潜在危险。影响脊柱骨性融合的因素有很多,许多研究希望通过寻找高性能的自体骨替代材料促进脊柱融合。由支架材料、种子细胞和生长因子复合构建的组织工程骨作为一种理想的自体骨组织替代物,有希望通过骨诱导方式促进脊柱融合,成为目前骨科研究热点之一。 我们采用Ⅰ型胶原酶消化法与贴壁培养法相结合,对存在于脂肪组织中的间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cell,ADSC)进行分离、纯化培养和体外扩增,运用免疫表型和诱导分化相结合的方法对培养的细胞进行鉴定。通过阳离子脂质体介导的基因转染将BMP-7基因转入ADSCs,筛选稳定转染细胞,通过BMP-7基因转染ADSCs促使其向成骨细胞分化,并过测定Ⅰ型胶原是否稳定表达来判断,为探索一种具有成骨诱导生物活性、促进脊柱融合的自体骨替代新材料奠定实验基础。 材料与方法 一、实验材料 新西兰大白兔,中国医科大学实验动物部提供。 二、实验方法 (一)兔脂肪间充质干细胞的分离培养及鉴定 1、兔脂肪间充质干细胞的培养 采用Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法,分离、纯化兔脂肪间充质干细胞,进行体外培养扩增。 2、兔脂肪间充质干细胞的鉴定 CD_(44)、CD_(49d)、CD_(106)检测细胞免疫表型。 向成骨细胞诱导:10~(-8)mol/L地塞米松、50μmol/L-抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的成骨诱导液中。 3、生物学性状的观察 用倒置显微镜每日观察细胞的生长情况并拍照。绘制第2代ADSCs细胞生长曲线。 (二)BMP-7基因转染脂肪间充质干细胞诱导其向成骨细胞分化的实验研究 1、真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7的重构、扩增纯化及鉴定。 2、建立稳定表达pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs细胞株,RT-PCR检测BMP-7表达。 3、相差显微镜观察细胞生长状态并免疫荧光检测Ⅰ型胶原的表达。 结果 (一)兔脂肪间充质干细胞分离、纯化、培养成功 1、Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织后所分离得到的细胞大多为圆形单个核细胞,贴壁生长后原代细胞及传代细胞生长状态良好。各代细胞形态基本一致,都为长梭形。 2、细胞免疫表型检测细胞膜表达CD_(44)、CD_(49d)阳性而CD_(106)的表达为阴性。地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠诱导组ALP、茜素红染色呈阳性。 3、绘制第2代ADSCs细胞生长曲线,通过分析可以看出ADSCs的增殖符合干细胞增殖规律,其增殖速度较快。 (二)通过BMP-7基因诱导,ADSCs成功诱导分化成骨样细胞 1、真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7重构、扩增纯化及鉴定成功。 2、成功稳定转染真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7-ADSCs细胞株。 3、BMP-7基因转染后细胞仍具有较高的增殖能力。 4、BMP-7基因转染后细胞能够稳定表达Ⅰ型胶原,且表达量较未转染组的表达量增高。 结论 1、通过Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法在体外能够成功培养出增殖能力强的兔脂肪间充质干细胞,可以作为组织工程的种子细胞。 2、经BMP-7基因修饰后的ADSCs能够稳定表达Ⅰ型胶原蛋白。
[Abstract]:Purpose Spinal fusion is one of the most commonly used procedures of the orthopaedic surgeon, but the failure rate of fusion High. The currently designed internal fixation device can ensure the immediate stability of the spine, provide the mechanical environment for bone fusion, but the long-term stability of the spine ultimately depends on the bone Fusion. Autograft in spinal fusion is generally considered to be a 鈥済old standard鈥，

本文编号：2421778