包皮成纤维细胞生物学特性研究及以其为饲养层对胚胎生殖细胞生长的影响

发布时间：2019-02-18 13:57

【摘要】： 人胚胎多能性干细胞来源于原始生殖嵴(primordial germ cells, PGCs)和囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),具有体外无限增殖能力和发育全能性等特征。PGCs和胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG细胞)作为干细胞之母在发育生物学及生殖系肿瘤研究等领域有其独特的理论和应用价值。但自1998年美国科学家先后分离得到人EG细胞和人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)以来,人ES细胞的研究热潮远远超过人EG细胞,究其原因为人EG细胞培养条件苛刻,难以获得能长期在体外培养的细胞系。因此优化人EG细胞培养体系必将推动其深入研究。饲养层(feeder cells)是体外成功培养人EG细胞的必要条件,因此寻找适合人EG细胞体外培养的饲养层是人EG细胞成功建系并用于实际的关键。目前在胚胎干细胞的培养及建系过程中通常采用STO细胞系或小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层,但小鼠来源的饲养层细胞可能给培养体系带来异源蛋白和遗传物质及逆转录病毒等,给培养体系造成污染,成为限制胚胎干细胞临床应用的瓶颈。因此,有必要建立人源性的饲养层细胞。胚胎成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫内膜基质细胞等都被采用作为胚胎干细胞体外培养饲养层,但其来源有悖于伦理道德或需经过妇科手术等而受到严格限制。包皮来源广泛,取材方便,国内外已有采用人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,HFF)作饲养层成功培养人ES细胞的报道,但还未见用其作为人EG细胞饲养层的报道。故我们采用包皮成纤维细胞作为人EG细胞体外培养的饲养层,进行了以下研究:1.以包皮环切术后儿童包皮为材料分离、培养、鉴定包皮成纤维细胞,并研究其生物学特性。2.以自行分离培养的包皮成纤维细胞为饲养层,分离培养人EG细胞,并进行鉴定。 1.包皮成纤维细胞生物学特性研究目的:研究包皮成纤维细胞生物学特性并检测其分泌物成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)的量。方法:取包皮环切术后儿童包皮分离、培养包皮成纤维细胞,用免疫细胞化学法检测P3代细胞纯度,流式细胞术及MTT法检测P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的细胞周期、生长曲线,MTT法测定不同浓度丝裂霉素C作用不同时间抑制HFF增殖作用及用ELISA法测定P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞上清液中FGF的量。结果: 1.包皮成纤维细胞呈贴壁生长,形成漩涡状、栅栏状或放射状有序排列,细胞形态多样。 2. P3代细胞波形蛋白染色显示成纤维细胞纯度达到95%以上。 3. P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的细胞周期大多数处于G0/G1期,为细胞进入S期做准备。P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞的生长曲线显示没有明显的滞留期,在1～6d都处于快速增殖期,第7d开始处于平台期,细胞周期与细胞生长曲线保持一致。 4.丝裂霉素C抑制包皮成纤维细胞增殖的最佳浓度和时间为12.5μg/ml作用2.5h。 5. P3、P9、P15、P20、P25、P30代细胞上清液中FGF的量在172.09±2.66 pg/ml～245.25±1.66 pg/ml之间波动。结论:包皮成纤维细胞的生物学特性表明其作为人EG细胞的饲养层是可行的。 2.包皮成纤维细胞作为饲养层对人EG细胞生长的影响目的:研究人EG细胞在包皮成纤维细胞饲养层上的生长并进行干细胞生物学鉴定。方法:分离5～11w流产胚胎PGCs,种植在包皮成纤维细胞饲养层上并连续传代,用碱性磷酸酶试剂盒检测其碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学法检测其胚胎表面特异性抗原SSEA-1、SSEA-4的表达,RT-PCR法检测转录因子Oct-4的表达。结果: 1.分离培养的人EG细胞具有人胚胎干细胞的典型形态和集落生长特征。 2. P3代人EG细胞集落AKP染色呈强阳性。 3. P3代人EG细胞集落胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-4表达阳性。 4. P3代人EG细胞集落转录因子Oct-4表达阳性。结论:包皮成纤维细胞作为饲养层能支持人EG细胞的生长并维持其未分化状态。综上所述,本实验研究了包皮成纤维细胞生物学特性及人EG细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状况,为人EG细胞的进一步研究进行了有益的探索。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】