骨髓间充质干细胞体外诱导山羊TMJ关节盘细胞的实验研究

发布时间：2019-03-08 16:45

【摘要】： 目的：通过用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和压缩力刺激山羊骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs),用组织学、免疫组织化学和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测经生物化学因子和生物力学刺激后的BM-MSCs产生的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),即Ⅰ型胶原和蛋白多糖,初步评价BM-MSCs做为颞下颌关节(Temporomandibular joint, TMJ)关节盘组织工程种子细胞的可行性,为进一步进行TMJ关节盘组织工程研究奠定基础。方法： 1、无菌条件下用18号骨髓穿刺针抽取1-3月龄刚刚宰杀的健康山羊股骨骨髓组织3-5ml, percoll淋巴细胞分离液分离培养。在倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化及贴壁率,测定其生长曲线。 2、取生长状态良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同浓度的bFGF诱导培养液进行诱导,收集在7,14,21天的上清液进行Ⅰ型胶原ELISA检测,细胞爬片组织学和免疫组织化学染色。甲苯胺兰和蕃红O染色检测糖胺聚糖(glycosmioglycan,GAG)、天狼猩红和Ⅰ型胶原免疫组化检测胶原,透射电镜观察细胞超微结构。 3、取生长状态良好的P3, P4 BM-MSCs,用不同浓度的bFGF诱导培养液诱导2周,再用2%琼脂糖包裹细胞,0-200KPa,0.1 Hz的压缩力连续加载1周,每天2小时。加载后做冰冻切片,进行组织学和免疫组织化学染色。甲苯胺兰和蕃红O染蛋白多糖、天狼猩红和Ⅰ型胶原免疫组化检测胶原。结果： 1、原代培养的山羊BM-MSCs接种后24 h可观察到贴壁细胞,大部分呈圆形、卵圆形,胞体较悬浮细胞大,部分细胞伸展变形,呈三角形,72h基本全部贴壁,大部分细胞为三角形和多角形,小部分为长梭形,可见细胞集落,第7-10天时细胞彼此相连,铺满瓶底,细胞以三角形为主,部分长梭形、多角形。传代后12h贴壁率达90%,大部分为三角形,6-7d即可长满瓶底。 2、细胞经bFGF诱导培养液进行培养后,细胞增殖速度减慢,边界清楚,大部分呈长三角形、梭形。甲苯胺蓝、蕃红O、天狼猩红染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色结果均呈阳性。超微结构显示细胞呈圆形或卵圆形,胞浆内有丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体,还有许多大小不等的溶酶体和核糖体,有的核糖体聚集成池。 3、BM-MSCs经bFGF诱导和压力加载后冰冻切片进行甲苯胺蓝、蕃红O、天狼猩红染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色结果均呈阳性。结论： BM-MSCs在体外培养增殖较快,且经数代培养后仍能保持原有的细胞形态,有种子细胞的生物学和形态学基础,在特定培养液诱导下能向软骨细胞或成纤维细胞样细胞表型转化,表达TMJ关节盘相关的ECM,有望成为纤维软骨组织工程较理想的种子细胞。
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【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】