未成熟树突状细胞分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的存活时间

发布时间：2019-04-02 12:39

【摘要】： 未成熟树突状细胞分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的存活时间第一章大鼠小肠移植模型的建立目的建立稳定而可靠的大鼠异位节段性小肠移植模型。方法近交系F344大鼠为供体,近交系Wistar大鼠为受体。取带血管的10cm-15cm左右小肠段作为供肠,带部分腹主动脉的肠系膜上动脉与受体肾下腹主动脉行端-侧吻合,供体门静脉与受体肾下下腔静脉行端-侧吻合。供肠近端结扎后固定于腹壁,远端肠管右下腹壁造瘘。结果共进行了56次正式实验,在未用免疫抑制剂的情况下,50例受体存活时间超过3天,造模成功率为89.3%。供体平均手术时间(37.3±1.6)min,受体平均手术时间为(57.3±4.1)min,其中动脉吻合(10.4±1.6)min,静脉吻合(8.9±0.7) min,移植小肠冷缺血时间(21.9±2.1) min,热缺血时间(19.3±2.0) min。受体大鼠(阴性对照组)生存时间最短为5d,最长为8d,平均(7.0±0.6)d。结论采用本方法建立的大鼠小肠移植模型稳定、可靠、成功率高,为后续实验打下了基础。第二章未成熟树突状细胞(imDC)分泌的exosomes制备与鉴定目的探讨体外诱导和扩增大鼠骨髓来源imDC,分离纯化imDC分泌的exosomes(imDex)的方法,并从形态学、分子表型和免疫学功能等方面对imDex予以鉴定。方法无菌条件下获取大鼠骨髓前体细胞,在GM-CSF(5ng/ml)+IL-4(5ng/ml)条件下进行体外诱导、扩增,隔日半量换液,第6天收获细胞。通过倒置显微镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面分子表达情况,ELISA检测细胞培养上清细胞因子含量,鉴定收获的细胞是否为imDC。再此基础上,收集培养6天的imDC细胞上清,超速离心法分离imDex,膜超滤离心法纯化除菌。透射电镜观察imDex形态,流式细胞仪检测imDex膜表面分子表达情况,混合淋巴细胞反应(MLR)进行imDex功能学检测。结果培养至第6天可获得imDC。电镜下可见细小树突状突起,流式细胞仪检测表明imDC低表达MHCII、CD80、CD86及CD40分子,ELISA检测显示imDC分泌促炎性细胞因子IL-12p70能力显著低于成熟DC(mDC)。超速离心imDC细胞上清可分离获得imDC分泌的imDex。膜超滤离心纯化除菌后透射电镜下观察可见imDex为直径介于50-100nm,具有典型脂质双分子层结构的小囊泡。流式细胞仪检测表明imDex高表达MHCII分子,低表达或不表达CD80、CD86及CD40分子。MLR检测显示imDex在imDC的辅助下刺激T淋巴细胞增殖的能力显著低于成熟DC(mDC)分泌的exosomes(mDex)。结论本法是体外制备大鼠骨髓来源imDC分泌的imDex的有效方法,为后续实验打下了基础。第三章ImDC分泌的exosomes延长大鼠小肠移植受体的生存时间及相关机制目的探讨静脉输注供体imDex能否有效的延长大鼠小肠移植受体的存活时间,并进一步研究imDex诱导移植免疫耐受的可能机制。方法供体为F344大鼠,受体为Wistar大鼠,供受体间进行异位节段性小肠移植。首先根据受体接受不同剂量供体来源的imDex处理将受体大鼠分为5组,A组(未处理组,n=6):移植前1周注射1ml生理盐水;B组(n=6):移植前1周注射含供体1μg imDex混悬液1ml;C组(n=6):移植前1周注射含供体10μg imDex混悬液1ml;D组(n=6):移植前1周注射含供体20μg imDex的混悬液1ml;E(n=6)组:移植前1周注射含供体50μgimDex的混悬液1ml。通过对不同剂量的供体imDex延长受体大鼠生存时间的比较,筛选出最佳剂量。再根据最佳剂量,重复大鼠小肠移植实验及分组:未处理组(n=6):移植前1周经阴茎背静脉注射1ml生理盐水;最佳剂量组(n=6):移植前1周经阴茎背静脉注射含供体最佳剂量imDex混悬液1ml。移植术后当未处理组出现移植排斥的表现是,收取各组大鼠的外周血、脾脏及移植小肠分析。ELISA法检测各组受体大鼠血清细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及TGF-β含量,混合淋巴细胞反应(MLR)检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力,并ELISA法检测MLR上清细胞因子IL-10及IFN-γ含量。流式细胞仪检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞比例,实时定量PCR检测各组受体大鼠脾脏T淋巴细胞Foxp3mRNA表达。常规病理切片(HE染色)观察各组移植小肠病理变化。结果A、B、C、D及E组受体平均存活时间分别为(7.0±0.6)天、(7.3±1.0)天,(9.8±1.2)天,(14.5±1.0)天和(7.8±1.2)。C组(10μgimDex)较A组(未处理组)受体存活时间轻度升高,差异有统计学意义(P0.05), D组(20μgimDex)受体存活时间显著高于C组(P0.05),B组(1μgimDex)及E组(50μgimDex)受体存活时间较A组差异无统计学意义(P0.05)。ELISA检测显示imDex(20μg)治疗组血清促炎性细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α较未处理组显著降低,而抑炎性细胞因子TGF-β含量则显著升高。MLR结果显示imDex(20μg)治疗组受体大鼠脾脏T淋巴细胞在同种异体抗原的刺激下增殖受到显著抑制,促炎性细胞因子IFN-γ分泌较未处理组显著降低,而抑炎性细胞因子IL-10分泌显著升高。流式细胞仪及实时定量PCR检测imDex(20μg)治疗组脾脏CD4+CD25+T细胞比例及Foxp3mRNA表达较未处理组显著升高。移植后第7天阴性对照组病理为急性重度排斥反应的表现,造瘘口坏死,闭塞,而imDex(20μg)治疗组为轻度排斥反应的表现,造瘘口粘膜红润,轻度水肿,分泌少许肠液。结论ImDC分泌的imDex可抑制大鼠小肠移植后的急性排斥反应,降低了受体血清促炎性细胞因子的变化,延长了受体存活时间。受体脾脏CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例升高,进而抑制受体初始T淋巴细胞增殖可能是imDex诱导移植免疫耐受的机制之一。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】