DNAM-1-nectin-2信号途径介导人NK细胞对猪内皮细胞直接杀伤作用的研究

发布时间：2019-05-14 17:05

【摘要】： 第一部分猪nectin-2分子的生物信息学预测、克隆及分析鉴定 [目的]证明猪nectin-2基因的存在，分析并克隆出nectin-2基因，明确其分子结构特点及表达特性。 [方法]运用生物信息学方法从美国基因数据库(GenBank)获得与人nectin-2基因同源的猪EST序列，通过RT-PCR、3’RACE等技术在猪内皮细胞系SV-40-PED中验证该序列的准确性，并研究其组织表达分布特点，利用体细胞杂交板(somatic cell hybridpanel，SCHP)技术对其进行染色体定位。根据反向PCR原理扩增该基因5’端调控区的未知序列。参照同源分子人PVR蛋白胞膜外区的三级结构，利用生物序列分析软件及数据库构建猪nectin-2蛋白胞膜外区的三维空间结构模型。 [结果]通过克隆测序与同源性分析，发现猪存在necin-2分子，其包含α、δ2种剪接体，它们具有相同的胞膜外区序列与不同的跨膜区和胞浆区序列，将此结果提交至美国基因数据库(GenBank)，并认定为我们新发现的基因，分别获得登录号EF195266和EU069826。necin-2在猪的各种组织细胞中广泛表达，尤其在猪内皮细胞中表达丰富。SCHP结果显示猪necin-2定位于6号染色体q21区域。通过反向PCR技术从猪nectin-2α的5’端非编码区延伸出371bp的未知序列。三维空间结构显示猪nectin-2蛋白胞膜外区形成V-C-C 3个免疫球蛋白样结构域，其中V样结构域由9个β折叠构成。 [结论]生物信息学方法和分子生物学技术的联合使用，有助于猪的新基因的发现与鉴定。本研究证实了猪存在nectin-2基因的推测，明确了该基因相关的结构信息，为研究nectin-2的免疫学功能奠定了基础。第二部分猪nectin-2胞膜外区融合蛋白的构建、表达与纯化 [目的]构建具有模拟天然nectin-2分子与受体DNAM-1相结合能力的胞膜外区融合蛋白nectin-2ED-IgGFc。 [方法]利用RT-PCR扩增猪nectin-2胞膜外区基因片段，连接至T载体，测序无误后，亚克隆至真核表达载体CD5lnegl，构建出重组质粒nectin-2ED-CD5lnegl。将重组质粒和空载体CD5lnegl分别转染至CHO细胞，用嘌呤霉素进行筛选；通过Western Blot、细胞免疫化学、免疫荧光和流式细胞术等方法检测，鉴定出能稳定表达融合蛋白nectin-2ED-IgGFc和IgGFc蛋白的细胞株。利用蛋白A+G琼脂糖珠亲和层析法分离、纯化融合蛋白。 [结果]经过双酶切和测序鉴定，重组质粒nectin-2ED-CD5lnegl构建成功。嘌呤霉素筛选出能稳定表达nectin-2ED-IgGFc融合蛋白和IgGFc蛋白的CHO细胞，从其细胞培养上清中分离、纯化出高纯度的融合蛋白。 [结论]成功构建并表达出融合蛋白nectin-2ED-IgGFc，该蛋白可作为猪nectin-2与人DNAM-1相互作用研究的重要工具。第三部分DNAM-1-nectin-2途径介导入NK细胞杀伤猪内皮细胞作用的研究 [目的]研究猪nectin-2与人DNAM-1异种受体配体之间的结合能力，建立能客观有效地评价人NK细胞对猪内皮细胞杀伤效果的实验方法，比较不同人NK细胞系(包括NK92和YT细胞系)对猪内皮细胞的异种杀伤能力。 [方法]利用流式细胞术和免疫共沉淀技术检测融合蛋白nectin-2ED-IgGFc与YT细胞系的DNAM-1之间的亲和能力。通过Western Blot比较DNAM-1在NK92与YT细胞系中的表达水平，用流式细胞术检测融合蛋白和抗DNAM-1中和性抗体与YT细胞结合的效率。建立用CFSE／PI双染法检测NK92和YT细胞系对猪内皮细胞系(SV-40-PED)细胞毒作用的方法，比较NK92与YT细胞异种杀伤效应的差异。 [结果]融合蛋白nectin-2ED-IgGFc能与人YT细胞表面的DNAM-1发生特异性结合。NK92与YT细胞DNAM-1的表达量无明显差异。YT细胞在与终浓度为10μg／ml的抗DNAM-1中和性抗体于室温孵育1h后，，抗体与YT细胞的结合率为48．53％。通过CFSE／PI双染法检测到，当效靶比为10：1，共同孵育时间为5、6和7小时后，对猪内皮细胞系(SV-40-PED)的杀伤率人NK92细胞分别为44．68％、53．99％和57．44％，人YT细胞分别为20．44％、20．60％和26．71％。 [结论]证明了猪nectin-2与人DNAM-1发生特异性结合的能力，这是DNAM-1-nectin-2途径发挥作用的重要前提。CFSE／PI双染法能够方便客观地检测NK细胞的杀伤效率。在杀伤条件完全相同时，NK92比YT细胞表现出更高的异种杀伤活性。以上结果为进一步研究DNAM-1-nectin-2信号途径介导人NK细胞对猪内皮细胞的杀伤作用奠定了良好的基础。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】