胚胎干细胞在成体骨髓中长期存活的观察研究

发布时间：2019-07-11 15:10

【摘要】： 目的胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)成为当今生命科学和生物技术研究的热点,这是因为它具有自我更新和多能分化的能力。多年来,“成体组织中是否存在胚胎干细胞”一直是一个很有争议的问题,很多实验室已报道可以从骨髓中分离出来ESCs样的多能干细胞,这些细胞都表达ESCs特异性标志Oct4基因,能像ESCs一样无限分裂繁殖,而且可以分化成几乎所有类型的细胞。但是对于这些原始细胞的来源和存在机制,人们并不清楚。因此,骨髓中是否存在ESCs就变成了一个很有争议的问题。之前的研究都是通过不同的方法从骨髓中分离、提取并培养这些ESCs样的干细胞,而我们首次通过相反的方式直接将小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里,通过观察ESCs在体内的分布生长情况,从而思考体内是否有这样一个适宜ESCs生存的环境。方法为了更好地追踪ESCs在体内的生长情况,我们新建两株带绿色荧光标记(green fluorescent protein, GFP)的ESCs——oGFP+ESCs(C57BL／6xOct4／EGFP转基因OG2小鼠)；和aGFP+ESCs(129／SvxCAG／EGFP转基因C57BL／6-Tg小鼠)。oGFP+ESCs中GFP的表达受Oct4启动子调控,Oct4表达时GFP才表达；aGFP+ESCs中GFP的表达受chicken-beta-actin启动子调控,无论细胞分化与否,GFP均表达。为了避免了ESCs在体内其它器官的阻滞和损失,我们直接将ESCs通过胫骨注射植入到同源的C57BL／6小鼠(分照射组和非照射组)骨链腔内。移植后,通过双光子荧光显微镜来观察GFP+细胞在小鼠骨髓腔里存活的时间和状态。另在不同的时间点,我们从移植小鼠的骨髓腔里再次分离出这些GFP+的细胞,采用建立ES细胞系的方法使这些Oct4+-GFP+细胞建成稳定细胞系,并检测这些新建细胞系的功能。通过基因芯片检测来比较这些细胞系和母代ESCs在基因表达水平上的差异。另一方面,我们通过流式细胞学检测和体外培养的方式,分析移植的ESCs在骨髓这种造血微环境下的分化特征。结果通过双光子荧光显微镜观察发现100天后,骨髓中仍然存在Oct4-GFP表达的类似ESCs的细胞。大多数GFP+细胞位于移植侧胫骨的注射部位,也有少部分GFP+细胞位于注射骨对侧的骨髓腔内。在不同的时间点,我们从移植小鼠的骨髓腔里分离出这些Oct4+-GFP+的细胞,建成稳定细胞系。到目前为止,我们成功建立了8株细胞系,形态同ESCs。通过对这些Oct4+细胞系的功能性检测发现它们具有与ESCs相似的特性,但这种细胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低,且不能生殖系传递。芯片结果显示这些细胞与母代ESCs比较,部分基因表达水平发生了改变,表观遗传学也发生了逐渐的变化。另外,移植的ESCs在骨髓腔内大多数分化成了非造血的细胞,形态多样,与骨质连接紧密,而仅有少部分分化成了造血细胞,并可进入血循环。结论1)我们的研究首次通过直接将ESCs移植入小鼠骨髓腔来证实了成体环境中长期存在ESCs的可能性,对以后干细胞的应用,在成体内的发育和分化研究具有一定的提示作用； 2)由于原始的胚胎干细胞在体内可以长期存在,因此在使用ESCs或ESCs衍生物做细胞治疗或移植过程中,安全性一定要长期关注； 3)胚胎干细胞在成体骨髓中存活一段时间后,逐渐发生了表观遗传学方面的变化,这种变化影响了ESCs的多能性改变,因此在以后细胞移植过程中,我们需要关注这些细胞表观遗传学方面的影响； 4)ESCs在骨髓腔内存活一段时间后,大多数分化成了非造血细胞。我们的研究首次说明了ESCs在骨髓微环境的分化趋势,对ESCs的分化潜能和周围环境的关系以及ESCs的应用具有一定的提示作用。
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图片说明： 1.feeder细胞的形态和密度:feeder细胞很容易贴壁，复苏后6小时基本贴壁牢固，这些细胞不增殖，只提供ESCs生长的养份，分裂细胞因子抑制ESC分化，因此需要合适密度的feeder细胞，太稀或太密，ESCs均容易分化，图1一1中feeder细胞的密度较适用于小鼠ESCs的培养。图1一1:典型的滋养层细胞形态和密度2.成功建立不同品系的带GFP荧光标记的小鼠胚胎干细胞系:通过不同品系的小鼠与相应的转基因小鼠交配 :oGFP+Eses(e57BLz6XoeZ);aGrP+Eses(12叨SvXe57Bu6一Tg)。oorP+EsCs:GFp的表达受oct’启动子调控，oct4表达时GFP才表达 ;aGFP+ESCs:GFP的表达受chinken一p一actin启动子和巨细胞病毒增强子调控，，即无论细胞分化与否，Oct4均表达。取交配后 E3.5囊胚(GFP+)种于feeder上面，3一5天内细胞团形成典型绿色克隆(图1一2)，将绿色克隆挑出接种到预先铺有feeder的96孔板里，一个孔一个克隆，通过逐步消化传代扩增，形成两株稳定的形态较好的小鼠胚胎干细胞系(图1一3)。ESCs呈一个一个克隆生长，边缘光滑，表面平滑，结构致密
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图片说明：北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文(二)双光子观察GFP+细胞1.光谱学分析:GFP的发射光谱是一条类似正态分布的曲线(图2一2)，最大峰值为 509nm，而如果是噪音或者自发荧光，它的光谱是没有规律的或者一直很高呈一平线(图2一3)。图2一 2:GFP十细胞的发射光谱曲线图2一3:自发荧光光谱曲线无规律2.双光子观察中，我们用glonln作为激发波长。两个NDD频道同时收集图像，绿色NDD频道的发射滤光器是495一54OIun，而红色NDD频道的发射滤光器是570一625run。在绿色NDD频道可见，而在红色NDD频道不可见的信号，即为GFP信号。因此结合两个NDD频道的成像和光谱学分析
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】