LCVN的可溶性表达及其N-末端特异性PEG修饰

发布时间：2019-07-11 18:27

【摘要】： 蓝藻抗病毒蛋白N (cyanovirin-N, CVN)是一种备受关注的HIV特异性microbicide候选物,作为一种异源多肽,存在半衰期短、易引起免疫应答等缺点；PEG修饰是解决蛋白质类药物在药用过程中存在的稳定性差,半衰期短等问题的有效途径,但CVN蛋白N-末端氨基酸、半胱氨酸和赖氨酸残基都位于其活性中心或活性中心附近,直接的PEG修饰会影响CVN与病毒表面糖蛋白gpl20的结合,从而影响其抗病毒活性。本实验中,在CVN的N-末端接入了(GGGGS)3的亲水柔性Linker序列(即LCVN),通过His6-SUMO的融合表达系统,SUMO-LCVN蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%。SUMO-LCVN融合蛋白比SUMO-CVN蛋白对SUMO蛋白酶更敏感,能被SUMO蛋白酶充分酶切,因此LCVN蛋白的制备更加高效,更适合大规模生产。分别以分子量为10KDa和20KDa的mPEG-ALD对LCVN的N-末端进行定点修饰,对反应pH、LCVN与mPEG-ALD的摩尔比进行筛选；得到了最佳的PEG修饰条件。反应时间对PEG修饰结果影响较小,室温2h即可反应完全。SP sepHarose阳离子交换亲和层析成功分离单PEG修饰产物(monoPEGyalted-LCVN),其纯度95%。在纳摩尔浓度范围,LCVN、monoPEGyalted-LCVN与gp120蛋白有较高的亲和力,并呈现一定的浓度依赖性。体外抗HSV-1和HIV-1活性实验表明：LCVN是一种细胞毒性更低、活性更强的CVN的衍生物；monoPEGyalted-LCVN抗病毒活性得到一定程度的保持,细胞毒性显著降低,能够有效抑制HIV感染细胞与未感染细胞的融合。本研究成功制备了纯度95%的重组LCVN蛋白及monoPEGyalted-LCVN, LCVN细胞毒性更低、活性更强；monoPEGyalted-LCVN细胞毒性显著降低,纳摩尔浓度范围能有效抑制HIV感染细胞与未感染的融合,这位开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。
文内图片： cyanovirin一N的二级结构114]

图片说明：个氨基酸残基组成，二级结构含有10个B一对称地分成A和B两个结构域，中间有铰链一定影响[l4];例如铰链区突变体PSIG在突变体S52P在溶液中二聚体是非常稳定的性能与天然蛋白完全一致，甚至晶体结构N无翻译后的修饰，其中有2个内部二硫N成熟蛋白中的两个二硫键分别位于第8V-N的氨基酸序列在1~50残基和51一101以及16对具有直接同源性的残基;这两段立级结构每个折叠相互之间都有众多的接列之间链的交换形成，这两个结构区域是和力113，，4，16，，71。
文内图片：

重组质粒pET3c一SUMO一LCVN双酶切鉴定及PCR鉴定Fig4.1RestrictinnandPCRanalysisofreeombinantPlasmidPET3e一SUMO一LCVN

图片说明：切后插入到表达载体PET3c中，，构建重组质粒pET3c一SuMO一LcvN，将重组质粒转化DH5a，挑单克隆阳性菌体，抽提质粒进行PCR鉴定和万由I和与BamHI双酶切鉴定(如图4.1所示)，对阳性结果送上海英骏生物技术有限公司测序，结果表明重组质粒构建成功。2D0150刃”250100图4.1重组质粒pET3c一SUMO一LCVN双酶切鉴定及PCR鉴定 Fig4.1RestrictinnandPCRanalysisofreeombinantPlasmidPET3e一SUMO一LCVN M:DL2000DNAmarker;Lanel:PET3e一SUMO一LCVN脚del+BamHI;LaneZ:PCR 1.2SUMO一LCVN蛋白的诱导表达图4.2是工程菌BLZI【pET3c一suMo一LcVN』经IPTG诱导后的蛋白表达图谱，可见经诱导后，在分子量28kDa处出现明显增粗的蛋白带(泳道3)，与His6一SUMO一LCVN的理论分子量相符，超声破碎后，目的蛋白位于菌体破碎后的上清中，为可溶性表达，凝胶经光密度扫描，含量占菌体可溶性蛋白的30%(泳道4)。另外，工程菌BLZI[pET-SUMo一LcVNI经30L的发酵罐发酵
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【参考文献】