串联亲和纯化与质谱技术对Mde4、Swi5、Sfr1蛋白复合物的鉴定

发布时间：2019-07-11 20:19

【摘要】： 细胞分裂过程中,染色体的正确分离得以将遗传物质精确地、均等地分配给两个子细胞。不正确的染色体分离会导致癌症的发生及先天性基因缺陷性疾病,如Down Syndrome就是由于多余的21号染色体拷贝。染色体分离这一复杂生物学进程是如何被精确而有序的调控的,其调控的具体分子机理一直以来都是生物医学研究者们的热衷问题。最近的研究显示,Mde4(SPBC6B1.04)、Swi5(SPBC409.03)及Sfr1(SPBC28F2.07)蛋白在染色体分离过程中发挥重要作用,但其蛋白复合物构成及调节机制仍然不清。在本实验中,我们开发了一种新的基于大片段同源基因重组的蛋白标记技术,即在Mde4、Swi5、Sfr1靶基因终止密码子上、下游临近区域设计引物,扩增出长度大约219-500bp左右的片段,并在片段两端引入酶切位点,从而将它克隆入我们所构建的含抗G418基因及TAP标记基因的pTAPKan1质粒载体中。重组质粒转化入酵母后,克隆PCR证实了我们的标记方法具有重组效率高及特异性好的特点。进一步的Western blot证实,所标记的TAP蛋白呈正常表达,经过两步串联亲和纯化后,蛋白银染色结果证实所纯化的蛋白样品以高纯度蛋白复合物形式存在。结合最新的质谱分析技术,我们在正常生理水平上对上述三种蛋白复合物进行蛋白质组学分析,研究不仅证实了已知的Swi5-Swi2及Swi5-Sfr1蛋白复合物的存在,而且发现了新的Mde4及Swi5作用蛋白,分别为Dnt1及Sir2蛋白,尽管其确切功能尚有待于发现,但有理由相信,这两种蛋白在染色体分离的调控过程中发挥着重要作用。进一步的磷酸化蛋白质组学技术证实在Swi5及Sfr1蛋白均存在着磷酸化位点。Swi5在第72号丝氨酸被磷酸化,而Sfr1包含有3个磷酸化位点(丝氨酸26, 109和165)。
文内图片：
图片说明： 在有丝分裂过程中,微管周围的中心粒结构会发生变化.减数分裂开始时,染色体开始重新排列,核结构的变化是由纺缍体结构中的微管所介导完成的,在减数分裂I期的分裂前期,这种核结构的变化被形象的称为马尾运动（图2.1）。图 2.1 减数分裂时细胞核的马尾运动，图上的数字分别代表不同时间点（min）端粒的聚集和核的马尾运动对于有效的同源配对和减数分裂时的同组来说是至关重要的，端粒结合蛋白 Taz1 和纺缍体结构构成蛋白 Kms1 在减数分裂期时端粒的聚集和马尾运动过程中发挥重要功能[100-104]，，dhc1 基因编码微管肌动蛋白的重链，敲除此基因导致马尾运动缺失，进而减少同源配对，而上述三种基因的突变会导致同源重组率降低 2－10 倍。有效的染色体配对和同源染色体重组需要适度的端粒聚集和马尾运动。这些过程有助于同源染色体的平行排列。在大多数真核细胞里，同源染色体的配对需要联会复合物（SC）的参与，SC 形成时
文内图片：
图片说明： 27图 3.2 Mde4、Swi5、Sfr１的 PCR 扩增结果lane1：in gene of Mde4, lane2：in gene of Swi5, lane3: Marker,lane4：in gene of Sfr１, lane5：out gene of Mde4, lane6：out gene of Swlane7：out gene of Sfr1.
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈睿;李清贤;杨绍华;;水稻花粉发育相关基因的研究进展[J];福建农业学报;2010年03期

2 陈睿;李清贤;于法科;杨绍华;刘华清;周淑芬;王锋;;一个水稻雄配子不育基因MGA1(t)的遗传及表达特征分析[J];分子植物育种;2011年06期

3 谢翠松;周宇清;曹仁贤;;RNA介导DNA甲基化的研究进展[J];医学分子生物学杂志;2005年06期

4 纪虹;孙开来;;小RNA的研究现状[J];国际遗传学杂志;2006年01期

5 关淑艳;楚海娇;刘慧婧;刘广娜;刘学志;王丕武;;玉米sbe2a基因RNAi载体的构建及转化玉米的初步研究[J];吉林农业大学学报;2011年02期

6 WILSON Zoe A;;Stamen specification and anther development in rice[J];Chinese Science Bulletin;2009年14期

7 骆继怀;独军政;常惠芸;;细胞核内RNA干扰途径研究进展[J];生物技术通讯;2011年03期

8 ;Characterization and mapping of a new male sterility mutant of anther advanced dehiscence(t) in rice[J];遗传学报;2008年03期

9 燕飞,成卓敏;RNA干扰机制研究进展[J];遗传;2005年01期

10 马建;刘艺苓;王丕武;;植物RNA干扰的研究进展[J];中国油料作物学报;2008年02期

相关博士学位论文 前10条

1 江蕾;UCP2在慢性肾脏病发病机制中的作用的研究[D];南京医科大学;2010年

2 万凌琳;水稻β-1，3葡聚糖苷酶基因Osg1的功能研究[D];武汉大学;2010年

3 连杰;男性不育相关蛋白MLH1和miR-383在精子发生中的功能研究[D];中国科学技术大学;2011年

4 李世国;裙带菜减数分裂相关基因UpMND1的克隆、鉴定与功能分析[D];辽宁师范大学;2011年

5 温砚子;布氏锥虫假基因来源的siRNA和NATs的鉴定及RNA编辑复合体MRB1亚基功能研究[D];中山大学;2011年

6 李晓洁;Neu3 siRNA对前列腺癌增殖迁移影响的研究[D];吉林大学;2011年

7 周时荣;水稻花粉半不育基因PSS1的图位克隆与功能研究[D];南京农业大学;2009年

8 张凌娣;同源序列高剂量异常表达及病毒编码蛋白对基因沉默的作用[D];中国农业大学;2004年

9 张宇;水稻第四号染色体精细物理图的构建和着丝粒的结构分析[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年

10 魏映辉;双色荧光RNAi技术平台的建立和抗SARS-CoV RNAi的研究[D];吉林大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 赵德尧;siRNA特异性及脱靶效应的研究[D];浙江理工大学;2010年

2 闰永荣;大麦醇溶蛋白RNAi植物表达载体的构建及幼胚高效再生体系的建立[D];甘肃农业大学;2010年

3 李清贤;一个水稻花药特异表达基因的克隆及初步分析[D];福建师范大学;2010年

4 张曼华;一个水稻雌雄不育突变基因的精细定位及候选基因的克隆[D];四川农业大学;2011年

5 闫永荣;大麦醇溶蛋白RNAi植物表达载体的构建及幼胚高效再生体系的建立[D];甘肃农业大学;2010年

6 海博;~（60）Co辐照处理对水稻育性的效应研究[D];广西大学;2011年

7 张玮;水稻半矮秆基因Sdg和强分蘖基因MT2候选基因的RNAi研究[D];扬州大学;2006年

8 江华;水稻分子标记体系的构建及水稻雄性不育突变体的基因定位[D];上海师范大学;2006年

9 张伟;植物染色体DNA重要组成因子—端粒和着丝粒序列的研究[D];华中农业大学;2005年

10 李凤艳;siRNA表达质粒文库的构建[D];首都师范大学;2007年

本文编号：2513454