编码鼠CD20腺病毒载体感染的树突状细胞诱导抗小鼠淋巴瘤免疫

发布时间：2019-07-12 15:57

【摘要】： 背景和目的 CD20阳性的B细胞淋巴瘤是临床上恶性淋巴瘤的最常见类型,目前免疫治疗在淋巴瘤的治疗中占有显著的地位。利妥昔单抗(Rituximab,美罗华)在临床上的应用显著地改善了CD20~+的B细胞淋巴瘤患者的预后。但美罗华单抗在体内产生的是被动免疫,而在抗肿瘤免疫中,主要还是以主动性的细胞免疫为主。刺激患者机体产生针对淋巴瘤细胞的细胞免疫反应,或同时刺激产生细胞和体液免疫反应是淋巴瘤免疫治疗的重要研究方向之一。 继手术、放疗和化疗之后,生物治疗已成为肿瘤治疗的重要手段之一。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前体内免疫系统中功能最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC),以DC为基础的肿瘤疫苗已成为当前肿瘤免疫治疗的一个重要策略。在诱发肿瘤特异性细胞免疫反应方面,树突状细胞(DC)起着关键性的作用,而以腺病毒为载体将目的抗原转送至DC中可大大提高DC的抗原提呈及诱导机体产生对该抗原特异性免疫反应的效率。 本研究探讨编码小鼠CD20的腺病毒载体Ad5/35修饰的DC诱导小鼠CD20+淋巴瘤的肿瘤特异性免疫,评价其对CD20+淋巴瘤细胞的免疫保护作用,为临床免疫治疗CD20+淋巴瘤提供一条新的思路和实验依据。 方法 1.建立稳定表达鼠CD20的肿瘤细胞株:将pcDNA3.1 mCD20/EGFP质粒用脂质体包裹后转染至B16.F10小鼠肿瘤细胞中,经G418筛选,以EGFP(增强型免疫荧光蛋白)作为报告基因,用流式细胞仪进行分选,最终获得B16.F10 mCD20/EGFP细胞株。 2.细胞毒实验:实验分2组,每组3只小鼠:实验组(Ad5/35 mCD20感染DCs组);对照组(空载腺病毒dl 70-3感染DCs组)。正常小鼠DC培养的第7天,将Ad5/35 mCD20及dl 70-3以100 pfu/DC的浓度与DC共同孵育4小时,收集DCs,计数,调整DCs数为5×10~5/200 ul。按每只小鼠5×105/200μl DCs皮内注射至小鼠左后腿上部背侧免疫小鼠,一周后杀小鼠取脾脏进行CTL细胞毒杀伤实验。以B16.F10mCD20/EGFP细胞作为靶细胞,免疫后小鼠脾细胞作为效应细胞,用3个效靶比(E:T)100:1、50:1和25:1,用乳酸脱氢酶释放实验检测CTL杀伤率。 3.体内荷瘤实验:取C57BL/6小鼠20只,4-6周(18±2)g,雌性,随机分为两组,实验组(Ad5/35 mCD20感染DCs免疫1次,10只),对照组(dl 70-3感染DCs免疫1次,10只)。具体免疫方法同细胞毒实验。免疫1周后,以生理盐水调整B16.F10 mCD20/EGFP细胞浓度为2×10~5个/200μl,按每只小鼠2×10~5 B16.F10 mCD20/EGFP细胞小鼠右后腿上部背侧皮下接种。接种后前14天隔日观察,14天后每日观察小鼠成瘤情况,此时尚未成瘤的小鼠继续观察至两个月。 结果 1.用G418筛选及流式细胞仪分选技术相结合的方法可获得稳定表达mCD20的B16.F10 mCD20/EGFP肿瘤细胞株,流式细胞仪检测99.1%的细胞表达EGFP,99.7%表达mCD20。 2.体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验:在效靶比为100:1、50:1和25:1情况下,实验组的杀伤率分别为63.83±7.72%,(t=15.33, P0.01)、47.70±5.31%(t=14.23,P0.01)和22.73±3.11%(t=8.74, P0.01),对照组的杀伤率分别为15.37±0.80%、12.83±2.84%和11.10±1.01%。实验结果有统计学意义。 3.荷瘤实验:对照组小鼠在接种2×10~5细胞的B16.F10 mCD20/EGFP细胞后16至18d内全部有肿瘤生长,实验组仅于18d(1只)、20d(2只)、24d(1只)共有4只小鼠成瘤,且肿瘤体积小于对照组。实验组其余小鼠继续观察至2个月,仍未见肿瘤生长。对照组成瘤率为100%,实验组为40%,两组间成瘤率有显著性差异(x~2=8.57, P0.01)。提示Ad5/35 mCD20能产生抗小鼠淋巴瘤的特异性免疫,对CD20~+的淋巴瘤小鼠有免疫保护作用。 结论 Ad5/35 mCD20免疫小鼠能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生,其CTL杀伤率与效靶比有关;Ad5/35 mCD20能产生抗小鼠淋巴瘤的特异性免疫,对CD20+的淋巴瘤小鼠有免疫保护作用。
文内图片：
图片说明： 调细胞浓度约2×106细胞／ml，取50μl细胞悬液到离心管中，加入兔抗鼠CD20单克隆抗体混匀进行免疫标记反应(工作浓度1:100)，同时做同型对照，4℃孵育30min，再用PBS洗涤3次，加藻红蛋白(PE)标记的羊抗兔二抗(工作浓度1:100)，避光孵育30分钟后，用PBS洗1-2次后重悬，上机检测。(五)电泳鉴定提取 B16.F10 mCD20/EGFP 细胞中的总 DNA，并以 5’-gga att cat gag tgg acc ttt ccca-3’为上游引物，，以 5’-cgg gat cct taa gga gcg atc tca tt-3’为下游引物，PCR 扩增后用凝胶电泳检测 mCD20 是否已整合到 B16.F10 细胞 DNA 中去。结 果1. G418 抗性选择约 12-14 天后对照组细胞全部死亡。转染组细胞则在 G418 抗性选择 3 周后得到稳定增殖的细胞克隆(图 1)。
文内图片：
图片说明： 2. 经流式细胞仪分选后扩增的细胞再次用流式细胞仪检测报告基因 EGF.F10 mCD20/EGFP 细胞中的表达水平，结果如图所示， 99.1%的细胞表达 E，左图为 B16.F10 细胞经流式细胞仪检测显示背景荧光为 0.81%，右图为 B1D20/EGFP 细胞经流式细胞仪检测显示 EGFP 表达为 99.1%(图 2)。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 魏林;邱飞;刁勇;;病毒载体的高分子修饰研究进展[J];病毒学报;2011年04期

2 唐小云;姬云丽;杨美荣;聂影;桂金秋;刘亚威;李福娟;;妊娠特异性糖蛋白对人外周血树突状细胞的免疫调节作用[J];热带医学杂志;2011年06期

3 柳云帆;吴小兵;阮力;;腺病毒载体在疫苗研究中的应用[J];生物技术通讯;2011年04期

4 刘爱平;杨瑜;张晓燕;;不同亚型树突状细胞与HIV-1相互作用的研究进展[J];中国免疫学杂志;2011年09期

5 陈新年;孔评石;夏惠;;间日疟原虫可溶性抗原对树突状细胞成熟的影响[J];检验医学与临床;2011年12期

6 黄红艳;王营;陈复兴;刘军权;周忠海;张娟;;姜黄素诱导的免疫耐受性人树突状细胞的研究[J];中国免疫学杂志;2011年07期

7 王琦;曾学军;;树突状细胞在类风湿关节炎中的研究进展[J];基础医学与临床;2011年08期

8 许惠惠;阮嫣峗;颜卫华;林爱芬;;HLA-G诱导DC细胞在免疫耐受机制中的研究进展[J];生命科学;2011年08期

9 杨文博;赵X;;树突状细胞的研究进展[J];医学综述;2011年15期

10 符雪莲;;蛋白酶体抑制剂硼替佐米对小鼠树突状细胞的免疫调节作用研究分析[J];吉林医学;2011年21期

相关会议论文 前10条

1 樊彩斌;温端改;欧阳骏;侯建全;严春寅;浦金贤;李纲;农绍军;;编码IKK2dn重组腺病毒载体的构建及表达验证[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

2 刘修恒;;小鼠骨髓源性不同成熟度树突状细胞培养鉴定[A];第十七届全国泌尿外科学术会议论文汇编[C];2010年

3 张庆红;胡玉珍;吕顺艳;钟延清;;雌激素影响大鼠树突状细胞的分化、成熟和功能[A];中国生理学会第六届全国青年生理学工作者学术会议论文摘要[C];2003年

4 郭大伟;梁健;姜晓峰;王学范;魏云涛;姜洪磊;;GPC3基因转染的树突状细胞诱导抗肝癌HepG2细胞杀伤作用的研究[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

5 张新华;钟翠平;顾云娣;顾晓;范强;王国强;周播江;;TGF-β1基因转染树突状细胞增强移植心脏耐受性并降低Fractalkine的表达[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

6 于益芝;刘书逊;王文雅;张明徽;郭振红;徐红梅;齐润姿;安华章;曹雪涛;;TRAIL在树突状细胞杀伤活化T细胞中的作用[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

7 尤长宣;罗荣城;张军一;苏瑾;廖旺军;郑航;Paul L Hermonat;;基因转移制备树突状细胞的实验研究[A];第一届中国肿瘤靶向治疗技术大会论文集[C];2003年

8 葛长勇;李鸿钧;孙茂盛;冯婷婷;靳昌忠;姚航平;吴南屏;;灭活SV40致敏的猴树突状细胞的生物学特性研究[A];2008年浙江省感染病、肝病学术年会论文汇编[C];2008年

9 葛长勇;李鸿钧;谢天宏;张光明;易山;孙茂盛;吴南屏;;恒河猴树突状细胞的生物学特性研究[A];中华医学会第四次全国艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全国热带病学术会议论文汇编[C];2009年

10 张尧;靳风烁;兰卫华;李彦峰;张克勤;吴刚;叶锦;;联合应用塞莱西布和CpG-ODN对树突状细胞功能的影响[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

相关重要报纸文章 前10条

1 章静波;干细胞研究新动向[N];健康报;2009年

2 记者 李天舒　通讯员 朱丹萍;一研究证实腺病毒载体依然是安全的[N];健康报;2011年

3 王雪飞;树突状细胞“面目”更清晰[N];健康报;2004年

4 记者 白毅;间充质干细胞可促进成熟树突状细胞增殖分化[N];中国医药报;2009年

5 刘伯宁;乔布斯的错误与斯坦曼的自我试验[N];南方周末;2011年

6 方彤;树突状细胞瘤苗新进展[N];健康报;2006年

7 本报记者 沈湫莎;这一次,诺奖会不会颁给逝者[N];文汇报;2011年

8 张献怀;树突状细胞疗法治疗恶性黑色素瘤[N];中国医药报;2004年

9 记者　毛黎;美发现一种“超级”形态酶[N];科技日报;2006年

10 杨淑娟;美研究出新型丙型肝炎疫苗[N];中国医药报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 潘建平;γ-干扰素对树突状细胞分化和功能成熟的调控及其基因修饰的树突状细胞抗肿瘤免疫机制研究[D];浙江大学;2002年

2 朱伟国;PPAR-γ激动剂吡格列酮抑制血管紧张素Ⅱ诱导树突状细胞免疫激活致动脉粥样硬化斑块不稳定的研究[D];浙江大学;2010年

3 王正昕;肿瘤微环境中浸润性树突状细胞的表型和免疫学功能的研究及其临床意义[D];第二军医大学;2000年

4 周向阳;新型热休克蛋白HSP-DC激活树突状细胞及其佐剂效应研究[D];第二军医大学;2003年

5 赵鸿;未成熟树突状细胞联合骨髓移植诱导大鼠异体肾移植免疫耐受的研究[D];复旦大学;2003年

6 陈玉丙;树突状细胞抗原负载及MAGE-3 DNA瘤苗研制[D];吉林大学;2004年

7 王宏伟;肺间质树突状细胞在多器官功能障碍综合征中的免疫激活与免疫耐受作用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年

8 赵毅;青藤碱对RA患者树突状细胞免疫功能的影响及机制研究[D];第一军医大学;2007年

9 刘海波;Fas信号激活树突状细胞炎性复合体形成的生物学意义与分子机制研究[D];第二军医大学;2010年

10 赵娟;受者来源的PIR-B转染的树突状细胞对小鼠异基因骨髓移植GVHD的保护作用[D];华中科技大学;2010年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘兵;编码人CD20的Ad载体诱发抗小鼠淋巴瘤特异性免疫的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年

2 吴鸣宇;黑色素瘤基因（MAGE-1）相关肽负载树突状细胞对肝癌细胞杀伤作用的实验研究[D];苏州大学;2003年

3 王晓刚;人白细胞介素23基因克隆和携带EGFP腺病毒载体的构建与鉴定[D];大连医科大学;2007年

4 陈媛媛;hIL-12腺病毒载体的构建及在人hBMSCs中的表达[D];山西医科大学;2010年

5 孟冬梅;急性髓细胞白血病细胞来源的树突状细胞的诱导及功能研究[D];青岛大学;2003年

6 梁军利;IFN-β1a对多发性硬化树突状细胞分泌的细胞因子影响的研究[D];广西医科大学;2010年

7 黄祺琦;耐受性树突状细胞来源的exosome治疗小鼠免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究[D];南昌大学;2010年

8 初晓霞;淋巴瘤树突状细胞的表达与临床分期、恶性度及预后的相关性研究[D];青岛大学;2002年

9 宋默;携带p53基因和Flt3L配体基因的腺病毒载体的构建及鉴定[D];大连医科大学;2010年

10 刘丽燕;MyD88在OK-432诱导树突状细胞成熟中的作用[D];福建医科大学;2010年

本文编号：2513808