约氏疟原虫子孢子与小鼠骨髓来源DC的相互作用研究

发布时间：2019-07-24 14:55

【摘要】： 疟疾是蚊媒传播的一种严重危害人类健康的热带传染病,在全世界有很高的发病率和致死率。疫苗是控制疟疾发病和阻止其传播的有效的方法,减毒子孢子疫苗虽然能够诱导宿主有效的抗疟原虫反应,但是因为材料来源等条件的限制而难以应用于现场。因而有效的亚单位疫苗的研制仍然是目前疟疾疫苗研究的重点,对红前期疟原虫免疫机制的深入研究对红前期亚单位疫苗的设计具有重要的指导意义。 DC作为体内重要的抗原递呈细胞,是架接宿主红前期特异天然免疫及适应性免疫的桥梁。最近的研究表明,感染疟原虫的按蚊叮咬宿主后,疟原虫子孢子侵入宿主皮下,部分子孢子可以进入毛细淋巴管,甚至可见少量子孢子在进入DC后仍可以进行一段时间的发育,而该部位的DC在启动红前期特异的CD8+T细胞的免疫反应,参与清除感染疟原虫的肝细胞中发挥重要作用。然而,进入毛细淋巴管中的子孢子是主动侵入DC还是被DC吞噬,及其对DC成熟诱导的作用和机制仍不清楚,对其机制的深入研究对阐明DC在红前期保护性免疫的产生中的作用具有重要的意义。 本研究首先通过构建约氏疟原虫子孢子与小鼠骨髓来源DC(bone marrow-dendritic-cells,BMDC)体外共培养平台,然后利用荧光显微镜技术观察子孢子与DC之间的相互作用,检测子孢子是否主动侵入DC;其次利用流式细胞技术检测对应时段DC的共刺激分子的变化情况;最后转染重组质粒pFLAG-CMV8-CSP至DC中,流式检测其对相关共刺激分子的影响,研究子孢子与DC相互作用及初步探讨其分子机制。研究主要包括两个方面: 一、子孢子诱导小鼠骨髓来源DC成熟: 1、子孢子与小鼠骨髓来源DC共培养的形态学观察:分离并诱导培养小鼠骨髓DC,第7天后与EGFP-BY265子孢子共培养2h、4h和24h后,荧光显微镜观察子孢子与DC的作用情况,发现大部分子孢子可以侵入DC,24h后疟原虫为类似肝期裂殖体的形态,说明子孢子可以侵入DC,并在DC内进行发育。 2、侵入的子孢子诱导DC成熟:子孢子与DC共培养2h、4h和24h后检测DC表面成熟相关共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表达情况。可见2h时,MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表达与正常DC对照组相似,无明显变化。4h时,加入子孢子的实验组MHC-Ⅱ、CD80和CD86的表达较对照组有所上调。24h时,MHC-II、CD80和CD86的表达上调比4h时更明显,基本达到LPS的阳性对照组的诱导水平。说明侵入的子孢子可以诱导DC成熟,从而为激活红前期特异的CD8+T细胞的反应提供重要的前提条件。 二、转染pFLAG-CMV8-CSP诱导DC成熟: 环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)是疟原虫子孢子主要的表面蛋白。自然感染情况下,子孢子在CSP和TRAP的介导下,能主动侵入KC,并躲藏于纳虫空泡内,避免吞噬溶酶体内各种酶对子孢子的杀伤作用。位于纳虫空泡内子孢子表面蛋白CSP在pexel功能域的作用下,能转移到肝细胞浆内,推测CSP可能参与入侵的子孢子对DC成熟的诱导。 我们首先构建了pFLAG-CMV8-CSP重组质粒,转染DC后24h,荧光显微镜下观察计算转染效率,达到40%以上,然后,采用流式细胞仪检测DC表面的CD80和MHC-Ⅱ类分子的表达情况,结果发现转染pFLAG-CMV8-CSP重组质粒与转染pFLAG-CMV8空质粒对照组相比,CD80表达明显上调,但是MHC-Ⅱ类分子的表达无明显变化。说明进入胞浆内的CSP可以诱导DC成熟,但可能并非通过MHC-Ⅱ类分子介导的途径。 本研究成功构建了约氏疟原虫子孢子与小鼠DC相互作用的体外研究平台,这为进一步研究子孢子与DC的相互关系奠定了基础。利用这个平台研究发现,子孢子可以侵入DC并在其胞内进行发育,并且侵入的子孢子能够诱导DC的成熟。我们将pFLAG-CMV8-CSP重组质粒转染DC后,发现子孢子同样能够诱导DC的成熟,说明侵入DC的子孢子CSP可以转移至胞浆内诱导DC的成熟。这为更好地解释DC与子孢子之间的相互关系,并进一步研究DC在疟原虫红前期天然免疫的作用和分子机制,以及设计基于DC的疟疾红外期疫苗奠定了重要的基础。
【图文】：

第三军医大学硕士毕业论文，1μl FITC 标记抗小鼠 IgG2b，0.8μl PE 标记抗小2b，温和混匀后，冰上孵育 30min，，用 1ml 4℃流式缓，重复洗涤一次后 100μl 流式缓冲液重悬沉淀细胞结 果度 BMDC天，镜下可见细胞表面有短小针状突起，呈现典型细胞表面 CD11c 表达情况，可见细胞高表达 CD1

A: 2h ; B: 4h ; C: 24h图 1-2：子孢子与 DC 共培养的形态学观察荧光显微镜(×400)Fig1-2: Morphlogy of DCs and sporozoites after co-cultureddetected with fluorescence microscope(×400)三、侵入的子孢子诱导 DC 表面共刺激分子及 MHC-Ⅱ类分子的上调子孢子与 DC 共培养 2h、4h 和 24h 后检测 DC 表面 MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表达水平。可见 2h 时，MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表达与正常 DC(medium 组)相似，无明显变化。4h 时，加入子孢子的 DC (SP 组)MHC-Ⅱ、CD80 和 CD86 的表达较 medium对照组有所上调。较 4h 时相比，24h 时 DC 表面 MHC-Ⅱ类分子、CD80 和 CD86 的表达上调更为明显，基本达到 LPS 刺激的阳性对照组的诱导水平(图 1-3)。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：2518701