铜绿假单胞菌中RND外排泵基因表达调节和功能研究

发布时间：2019-07-25 09:03

【摘要】：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),原称绿脓杆菌,是一种革兰氏阴性菌,在自然界分布广泛,水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有此菌存在。同时,铜绿假单胞菌也是一类条件致病菌,是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者,以及术后或某些治疗后的患者易感染此菌,经常引起肺炎、术后伤口和烧伤面感染,也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。铜绿假单胞菌引起的感染可导致菌血症和败血症的发生。烧伤后感染铜绿假单胞菌可能会造成患者死亡。由于铜绿假单胞菌的内在性和获得性多重耐药性,导致对其的治疗变得很困难。铜绿假单胞菌的内在多重耐药性,是外膜低通透性和大量外排系统共同作用的结果。目前,在铜绿假单胞菌中已发现了5类外排系统家族。其中,RND (resistance-nodulation-cell division)外排泵系统是这些外排系统家族中重要的一员,与抗生素外排直接相关；几乎所有此类外排泵家族成员都与细菌耐药性相关,是细菌耐药性产生的主要原因之一。因此,研究铜绿假单胞菌中RND外排泵,揭示细菌耐药机理,筛选外排泵抑制子,对了解和控制铜绿假单胞菌耐药性具有重要意义。虽然现在对铜绿假单胞菌RND外排泵的研究已经有很多,但是,一些重要的基本问题还没有解决。本研究以铜绿假单胞菌中RND外排泵家族成员为研究对象,构建了12个RND外排泵单突变体；同时结合以无启动子的荧光素酶基因操纵子luxCDABE为报道基因,构建了检测12个RND外排泵表达的报道子,对铜绿假单胞菌中RND外排泵家族进行研究。主要针对铜绿假单胞菌中RND外排泵家族成员的表达水平比较；锌离子(Zn2+)对外排泵基因表达水平的调节；外排泵家族成员外排抗菌制剂时的主次地位进行了系统的研究。具体研究内容和结果包括：第一部分,对铜绿假单胞菌中RND外排泵家族成员的表达谱、锌离子对其表达的诱导、RND外排泵在抗生素耐药性中的作用进行了系统的研究。研究结果显示：除了已报道的四个RND外排泵mexAB-oprM, mexPQ, mexVW, mexXY,在铜绿假单胞菌中mexJK和muxABC-opmB也属于组成型表达；RND外排泵中mexAB-oprM, mexJK, mexXY和czcCBA的启动子表达受到硫酸锌的明显诱导,而且czcCBA受诱导程度最显著。通过抗生素耐药性实验发现：MexAB-OprM突变体对多种抗生素的抗性下降；而MexGHI-OpmD和MuxABC-OpmB突变体表现出抗生素抗性升高；同时,除了CzcCBA突变体,MexGHI-OpmD和MexXY-OprM突变体对锌离子抗性下降。同时,实验结果表明：CzcCBA的单突变体,PAO(AczcC)在有硫酸锌存在下,表现出对多种抗生素敏感性增大,揭示金属离子对抗生素抗性的影响。这些结果表明：在RND外排泵中,MexAB-OprM是外排泵家族中发挥主要作用的外排泵家族成员,对氯霉素、环丙沙星、土霉素、四环素和链霉素的外排起到第一级的作用；MexAB-OprM和MexEF-OprN在外排泵家族中,对氨苄青霉素的外排起到第一级的作用；CzcCBA, MexGHI-OpmD和MexXY-OprM在外排泵家族中,对锌离子的外排起到第一级的作用；锌离子在铜绿假单胞菌的抗生素抗性中也发挥着重要的作用；第二部分,对当时功能未知的RND外排泵家族成员MuxABC-OpmB的抗性和致病性等特点进行深入的研究。这一RND泵功能在2009年已有报道,但本研究通过抑菌实验和致病力实验首次发现,这个外排泵的单突变可以导致铜绿假单胞菌对抗生素氨苄青霉素和羧苄青霉素抗性升高,并造成致病力下降。证明MuxABC-OpmB不仅与铜绿假单胞菌的抗生素抗性相关,也和细菌的致病性相关；而致病力的下降至少部分原因是由于突变体蹭行运动能力丧失造成的；第三部分,本研究以czcCBA表达水平受锌严格调控特为依据,构建了一组在假单胞菌属细菌中可控的表达系统-pLY系统。通过连入lux报道基因和sacB基因,对这套表达系统的可控性进行了验证,实验结果表明,本研究构建的表达系统只能在假单胞菌属细菌中作用,锌离子的浓度能够控制连入基因的表达强度,且其在转录水平上表现为对锌离子浓度梯度依赖；第四部分,利用同源性比较,在铜绿假单胞菌中找到了6个金属离子外排泵(CzcD1、CzcD2、ZntA1、ZntA2、YvgX和YiiP),并构建了它们的报道子和突变体；以此为基础,检测了抗生素和金属离子对它们表达水平的影响,以及它们是否具有对抗生素和金属离子的双重外排功能。结果表明,虽然不同抗生素对这六个金属离子外排泵的表达有不同程度的影响,但没有检测到明显的金属离子和抗生素的协同诱导作用；药物敏感性实验结果表明：ZntA1参与到镉和锌的外排,ZntA2与镉的抗性有关；CzcD2突变体表现出钴的敏感性升高。但是,这些单突变体的抗生素敏感性变化不明显。综上所述,本研究对铜绿假单胞菌中RND外排泵家族所有成员的基因表达调节、功能特点、外排泵家族成员外排抗菌制剂中的主次地位,以及金属离子对铜绿假单胞菌的抗性影响进行了系统研究。对铜绿假单胞菌的耐药性、致病力形成机理进行了探索,实验结果最终将有助于对病原菌耐药性的控制。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】