CD1d四聚体检测技术的初步改良

发布时间：2019-07-26 20:25

【摘要】： 前言 NKT细胞TCR识别由非胸腺依赖抗原与CDld结合而成的复合物。α-GalCer为目前发现的NKT细胞结合效能最强的糖脂抗原,其可以装载入CDld分子抗原结合沟槽,应用此糖脂和分子所建立的CDld四聚体技术是检测NKT细胞的权威方法。 肝脏是机体最大的消化与代谢器官,然而其在免疫学领域的作用日渐清晰,甚至有人已把肝脏作为独立的免疫器官；NKT细胞在肝内单个核细胞比率达到8%-15%,为所有具备淋巴样器官中最多的器官。本试验即利用肝脏内NKT细胞比率较高的特性,以评定不同制备条件建立的四聚体检测效果,从而对其制备条件进行改良。不同肝脏单个核细胞制备方法可对NKT细胞比率产生影响,选择一种稳定的制备方法也是保证改良方案实施的重要基础。 Tween-20是常用的实验室有机助溶剂,属水包油型乳化剂,可用作增溶剂、扩散剂、稳定剂、润滑剂和抗静电剂。CDld四聚体在制备过程中用含有Tween-20的PBS分散糖脂抗原是能否建立成功四聚体的关键步骤,但其亦能对反应体系造成不利影响,因而在保证其分散效果的同时也应该控制Tween-20在整个反应体系里的量才能找到一个理想的平衡点。a-GalCer与融合蛋白的孵育时间是CDld四聚体制备过程的限速步骤,现今的制作流程中二者的孵育时间皆在12小时以上,这完全限制了CDld四聚体技术的快速应用。 本研究建立的CDld四聚体技术可对小鼠胸腺、脾脏、肝脏iNKT细胞进行检测,并对CDld四聚体制作过程的PBS所含Tween-20浓度及a-GalCer与融合蛋白的孵育时间进行摸索,希求应用最少的Tween-20及最短的孵育时间达到良好稳定的检测效果的目的。 方法 以肝脏内单个核细胞为检测对象,利用含Tween-20不同浓度PBS所建立CDld四聚体检测其NKT比率,通过对比Tween-20浓度不同对CDld四聚体检测效率的差异,确定最合理的Tween-20浓度；以肝脏内单个核细胞为检测对象,利用糖脂a-GalCer与CDld-IgG1 Fc融合蛋白经不同孵育时间所建立CDld四聚体对其NKT比率进行检测,通过对比孵育时间的不同对CDld四聚体检测效率的差异,确定最合理的孵育时间。 结果 CDld四聚体检测NKT方法的建立应用保守建立方法,即用含Tween-201%的PBS稀释a-GalCer糖脂储存液,并与CDld-IgG1 Fc融合蛋白孵育过夜12小时所建立的四聚体检测液对所提纯肝脏单个核细胞、胸腺细胞、脾脏单个核细胞进行检测,可检测到NKT细胞亚群,其检测阳性比率与国外文献相符,表明四聚体建立成功。 用含不同浓度Tween-20 PBS (0.00%、0.05%、0.10%、0.25%.0.50%、1.00%、2.00%)制备的CDld四聚体检测肝脏单个核细胞内NKT细胞,对其检测效率进行比较,在0.5%至2%范围内增加时,所测得NKT细胞比率稍有下降趋势或比率相当,统计学处理Tween-20浓度在0.5、1%、2%时,三者的检出能力无统计学差异,显示Tween-20在0.5%时即能制备出具有完整检出能力的CDld四聚体。 不同糖脂a-GalCer与CDld-IgG1 Fc融合蛋白装载时间(1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h)所制备的CDld四聚体检测肝脏单个核细胞内NKT细胞,对其检测效率进行比较。数据表明,随装载时间在1h、2h、4h、6h、8h范围内不断增加,所测得NKT细胞比率不断增加；在8h、12h、24h范围内增加时,所测得NKT细胞比率稍有下降趋势或比率相当,统计学处理装载时间在8h、12h、24h时,三者的检出能力无统计学差异,显示装载时间8h时即能制备出具有完整检出能力的四聚体。 结论 建立CDld四聚体检测技术,可以对肝脏、胸腺、脾脏NKT细胞进行检测。在CDld四聚体制备过程中,用于分散a-CalCer糖脂抗原的PBS所含Tween-20的浓度可降低到0.5%。在CDld四聚体制备过程中,a-CalCer和CDld-IgG1 Fc融合蛋白的孵育时间可缩短到8h。
【图文】：

Y6T细胞及B细胞在肝脏单个核细胞比率2、CDld四聚体检测NKT方法的建立应用保守建立方法，即用含T切een一201%的PBS稀释糖脂储存液，并cDld一lgGIFc融合蛋白孵育过夜12小时所建立的四聚体检测液对所提纯肝脏个核细胞、胸腺细胞、脾脏单个核细胞进行检测，，可检测到NKT细胞亚群，其测阳性比率与国外文献相符，表明四聚体建立成功。所得NKT细胞比率如图所

四聚体检测胸腺细胞NKT细胞比率(左为对照，右为CD4、CDld四聚体双染)注:Ql十QZ区为四聚体阳性区
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392-3

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 ;Isolation of Lymphocytes and Their Innate Immune Characterizations from Liver,Intestine,Lung and Uterus[J];Cellular & Molecular Immunology;2005年04期

2 刘景华;窦立萍;王莉莉;于力;;CD1d四聚体检测NKT细胞[J];细胞与分子免疫学杂志;2009年01期

3 ;Isolation of murine hepatic lymphocytes using mechanical dissection for phenotypic and functional analysis of NK1.1~+ cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年13期

本文编号：2519784