IGF-1基因转染兔脂肪间充质干细胞诱导向软骨细胞分化的实验研究

发布时间：2019-08-03 16:52

【摘要】： 前言关节软骨容易发生损伤和退变,再生能力差,对软骨损伤的实验治疗主要集中在细胞治疗上,包括应用成熟软骨细胞、软骨祖细胞及其他细胞等。脂肪间充质干细胞(ADSCs)作为成熟软骨细胞的替代品越来越受到重视。ADSCs可以很容易从脂肪组织中获得,增殖传代能力强,细胞均一性好,具多向分化潜能,能分化为各种类型组织,包括软骨和骨。但转移的ADSCs在软骨缺损部位还没有产生令人满意的关节软骨,一个可能的问题是局部没有足够能刺激移植细胞分化的细胞因子。体外研究报告显示,特异的蛋白因子能够促进成人ADSCs向软骨分化,提高体内软骨修复能力。相关的研究表明:TGF-β_1,TGF-β_2,TGF-β_3,FGF,BMP-2,BMP-6,IGF-1等生长因子具有成软骨能力,因此可以在局部加入这些因子促进ADSCs向软骨细胞分化。但外源性细胞因子易于流失、作用时间短、价格昂贵。故设想将这些细胞因子的基因导入ADSCs中,通过自分泌相应细胞因子诱导ADSCs向软骨细胞分化,以此基因修饰的ADSCs作为种子细胞来构建组织工程软骨,用于软骨缺损和退变的治疗将具有重要意义。目前,应用IGF-1基因转染ADSCs国内外尚未见报道。本研究采用Ⅰ型胶原酶消化法与贴壁培养法相结合,对存在于脂肪组织中的间充质干细胞进行分离、纯化培养和体外扩增,对其生物学特性进行初步研究。利用阳离子脂质体介导的基因转染法将IGF-1转入ADSCs,G418筛选阳性克隆细胞并结合低血清培养基诱导向软骨细胞分化,为软骨缺损及退变的基因治疗奠定基础。材料与方法一、实验材料新西兰大白兔,由中国医科大学实验动物部提供。二、实验方法 1、兔脂肪间充质干细胞的分离培养及其生物学活性观察 (1)兔脂肪间充质干细胞的培养采用Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法,分离、纯化兔脂肪间充质干细胞,进行体外培养扩增。 (2)向成骨细胞诱导抗坏血酸、地塞米松及β-甘油磷酸钠联合诱导向成骨细胞分化。碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定成骨细胞。 (3)生物学性状的观察用倒置显微镜每日观察细胞的生长情况并拍照。 2、IGF-1基因转染兔脂肪间充质干细胞诱导向软骨细胞分化的实验研究 (1)真核表达质粒pcDNA3.1-IGF-1的扩增纯化及鉴定。 (2)建立稳定表达pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs细胞株,RT-PCR及Western blot检测IGF-1表达。 (3)相差显微镜观察细胞生长状态并1%甲苯胺蓝染色。 (4)MTT法绘制基因转染前后细胞增殖曲线,流式细胞仪分析细胞周期。 (5)免疫荧光法检测Ⅱ型胶原表达。 (6)透射电镜观察细胞超微结构。结果 1、兔脂肪间充质干细胞分离、纯化、培养成功 (1)Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织分离得到的细胞大多为圆形单个核细胞,贴壁生长后,原代及传代细胞生长状态良好,各代细胞形态基本一致,为长梭形。 (2)抗坏血酸、地塞米松及β-甘油磷酸钠诱导组ADSCs ALP及钙结节表达阳性。 2、通过基因转染IGF-1,ADSCs成功诱导分化成软骨细胞 (1)真核表达质粒pcDNA3.1-IGF-1扩增、纯化成功。 (2)成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1-ADSCs细胞株。 (3)稳定转染IGF-1后细胞变圆并聚集呈结节样生长,1%甲苯胺蓝染色阳性。 (4)稳定转染IGF-1后细胞增殖能力增强,流式细胞S期比例增大,G_1期比例减小,p＜0.05。 (5)稳定转染IGF-1后细胞Ⅱ型胶原表达阳性。 (6)稳定转染IGF-1后细胞的超微结构提示细胞合成代谢旺盛,细胞功能活跃。结论 1、通过Ⅰ型胶原酶消化后贴壁培养的方法,在体外分离培养出增殖能力强的兔脂肪间充质干细胞。 2、通过基因转染ADSCs IGF-1成功诱导成软骨细胞,能够稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。
【图文】：

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IGF-1基因转染兔脂肪间充质干细胞诱导向软骨细胞分化的实验研究

细胞培养瓶内贴壁生长的ADSCS2、免疫荧光法测定细胞BD表型免疫荧光试验的结果显小在ADScs中，抗原决定簇cD44、CDI。9弥散分布细胞膜表面，在荧光显微镜下细胞膜表面被激发出绿色荧光，结果如下:
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

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