可溶型SRA对慢性HBV感染特异性CTL应答的调节作用

发布时间：2019-08-03 12:07

【摘要】：对病原体的易感性取决于机体的抵抗力,而抵御病原体入侵的第一道防线是天然免疫。天然免疫系统由许多种类识别及效应分子组成,通过模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)如Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)、甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)、清道夫受体(scavenger receptor, SR)、肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)、甘露糖受体(mannose receptor, MR)等特异识别病原微生物表面的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMP),产物免疫应答,构成机体的抗感染的第一道防线；并通过抗原提呈、提供共刺激信号、调节细胞及趋化因子的分泌,启动获得性免疫应答同时指导应答的性质和强度。清道夫受体A (scavenger receptor A, SRA),也称为巨噬细胞清道夫受体(macrophage scavenger receptor, MSR)或CD204,主要表达在吞噬细胞或抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)如巨噬细胞(macrophage, MΦ)和树突状细胞(dendritic cell, DC)表面,是最早发现并克隆的能结合低密度脂蛋白活性的清道夫受体家族成员。大量研究揭示,SRA在动脉粥样硬化病程发生、发展及其宿主防御中发挥重要作用。另外,研究表明SRA对内毒素休克、高氧性肺损伤及阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease, AD)有保护作用。 APC利用PRR参与天然免疫对病原微生物的识别和免疫应答启动。近期研究揭示了PRR(包括TLR、MR、FcR、DC、SIGN/CD209.SR及CD205等)在干预DC的功能、维持免疫系统稳态、宿主免疫调节及防御中发挥着重要作用。前期研究显示针对SR进行抗原化学修饰能够显著提高抗原的免疫原性。最新研究证据揭示了一些SR包括SRA可影响APC对应激相关蛋白和相关抗原的摄取。可是,SRA在抗原提呈和获得性免疫应答中的作用机制仍有待进一步阐明。 SRA的意义在于介导相关配体结合和内吞,近期研究发现SRA在人肝损伤组织中表达显著增加,这促使我们去研究SRA在机体肝损伤中的具体作用。已报道,髓系来源抑制性细胞(MDSC)上表达的SRA参与对T细胞活化抑制和后续肝损伤。我们报道CIH疾病动物模型血清中有可溶性SRA的释放且SRA蛋白可抑制T细胞的活化。然而,目前尚不清楚具体是何原因导致可溶性SRA分子的释放,肝功能损伤病人体内是否存在可溶性SRA表达还有待进一步检测。乙型肝炎病毒(hepatifis B virus,HBV)感染后引起一系列肝脏疾病[无症状携带、急性肝炎、慢性乙型肝炎(chromc hepatitis B,CHB).肝硬化和肝癌等]。我国HBV感染率高达57.63%,全国至少有6亿人感染过HBV,每年因HBV感染相关肝病死亡的病患高达30万人。目前尚未发现能彻底清除HBV的药物,因此HBV感染已经成为严重影响我国人民健康的公共卫生问题。HBV感染后,宿主的免疫应答是一把双刃剑,既能抑制、杀伤及清除病毒,又能引起炎症反应、造成机体(特别是肝细胞)的损伤。免疫系统是一个相当复杂的系统,可以肯定的是其在HBV慢性感染的病程和转归中发挥重要作用。但在HBV感染的过程中,免疫系统是如何启动、工作和相互协调,与HBV间的相互作用及其关系如何,在疾病的发展过程的变化情况,目前还没有完全清楚。本课题检测了慢性HBV感染病人中可溶性SRA的表达情况,因其提取和纯化的限制,为了进一步研究SRA作为胞外可溶性蛋白的天然免疫功能及其对获得性免疫的调节作用,我们在大肠杆菌内诱导表达了人SRAECD蛋白,通过蛋白复性及纯化,获得了具有生物学活性的重组蛋白。初步探索人SRAECD蛋白对HBV感染T细胞免疫应答的影响及其分子机制。第一章慢性HBV感染情况下可溶性SRA的表达乙型肝炎病毒感染可引起一系列严重的肝脏疾病,包括急性和慢性肝炎,肝硬化和肝细胞癌(HCC)。有大量研究证实乙型肝炎病毒本身并不导致肝细胞的损伤,乙型肝炎病毒感染后主要受到宿主免疫系统对病毒抗原的应答,从而引起肝细胞损伤,天然免疫与获得性免疫(细胞免疫和体液免疫)均起着重要作用。宿主的免疫反应不仅仅起着清除病毒的作用,还会进一步的造成肝细胞的炎症及损伤,它们之间的相互作用决定着相关疾病的发生、发展和预后。已报道,CIH疾病动物模型血清中有可溶性SRA的释放且抑制T细胞的活化。在本次研究中,我们检测了慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表达量。本节实验涉及到的全血标本共112份。其中22份来自于健康成人(healthy control, HC);28份来自于免疫耐受期的HBV携带者(immunotolerant carder,IT)；33份来自十非活动性HBsAg携带者(inactive Carrier, IC);29份来自于慢性乙型肝炎患者(chronic hepatitis B, CHB)。HC对照的入组标准为HBsAg阴性、ALT/AST正常、无其他严重疾患。IT、CHB和IC的诊断标准参考慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。排除标准为：混合感染HIV、HCV或其它肝炎病毒；急性肝炎、肝硬化或肝癌；半年内接受过乙肝抗病毒治疗。相关实验符合赫尔辛基宣言的要求,并得到南方医科大学南方医院伦理委员会的批准,所有患者都签署了知情同意书。血清学和病毒学(HBV DNA定量、HBV血清标志物和其他病毒标志物)的检测由南方医院肝病中心实验室完成。采用荧光定量PCR进行HBV DNA的定量检测。采用化学发光法检测HBV血清标志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)。酶联免疫吸附试验(ELISA)筛查其他肝炎病毒(HCV、HDV和HEV)标志物。应用胶体金法筛查HIV-1和HIV-2。ELISA检测血清中SRA。结果表明,HBV慢性感染后,IT期患者血清中可溶性SRA的表达量会升高,当HBV特异性应答激发后,SRA表达进一步提高,但当病毒得到控制,IC期患者可溶性SRA的表达量会有所下降,得到一定程度的恢复。第二章人SRAECD蛋白的原核表达在慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表达量增加,为了进一步研究SRA作为胞外可溶性蛋白的天然免疫功能及其对HBV感染的免疫调节作用,我们采用分子生物学技术,应用原核表达系统获得人SRA胞外段蛋白。我们从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中提取RNA,逆转录为cDNA,采用PCR技术从PBMC-cDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+)质粒中,经PCR、限制性酶切和基因鉴定测序确证后,导入感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3),在卡那霉素抗性的筛选培养基上获得了表达目的基因的pET41a-SRAECD重组大肠杆菌,以IPTG诱导其表达hSRAECD/His融合蛋白,超声裂菌后,经SDS-PAGE鉴定融合蛋白存在于包涵体中。包涵体形式的hSRAECD/His融合蛋白经谷胱甘肽氧化-还原系统进行复性,再以Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,经SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定,获得了纯化的hSRAECD蛋白。为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。第三章人SRAECD蛋白对HBV感染T细胞免疫应答的影响有研究表明,研究发现SRA在人肝损伤组织中高表达,髓系来源抑制性细胞上表达的SRA参与对T细胞活化的抑制和后续肝损伤。已报道CIH动物模型血清中有可溶性SRA的释放且SRA蛋白可抑制T细胞的活化。我们发现慢性HBV感染病人的血清中可溶性SRA的表达量增加。本部分工作主要是分离和培养人外周血单个核细胞(PBMC),旨在探讨人SRAECD蛋白对HBV感染后细胞免疫的影响。无菌分离人外周血单个核细胞,FCM检测了人SRA胞外段蛋白对HBV抗原肽刺激CTL胞内细胞因子IFN-γ和TNF-α的影响,发现SRAECD蛋白可减少分泌IFN-γ和TNF-a的HBV特异性CTL细胞数目。FCM检测了SRAECD与HC/CHB患者T细胞的结合,结果证明SRAECD可与HBV感染患者的T细胞结合,明显高于HC组。同时实验CFSE标记PBMC,将ConA或anti-CD3/28mAb、不同浓度GST-SRAECD蛋白及对照GST蛋白加入PBMC中,24小时收集细胞培养上清检测细胞因子IL-2的分泌,夹心ELISA检测IL-2水平,结果表明,GST-SRAECD可明显抑制ConA诱导的PBMC分泌IL-2,且呈剂量依赖性。FCM检测CD3+T细胞的增殖情况。结果显示,与加入GST蛋白的对照组相比,SRAECD蛋白可明显抑制CD3+T细胞增殖,且呈剂量依赖性。同时我们研究证明SRAECD可与T细胞结合,且与anti-CD3/28mAb刺激的PBMC结合明显高于未刺激组。rhIL-2能逆转SRAECD蛋白抑制T细胞增殖。综上,本次研究揭示了HBV感染及慢性乙肝疾病的转归过程中SRA的表达变化,丰富了对HBV感染过程中宿主免疫调节的认识。SRA抑制抗HBV特异性CD8+T细胞效应,提出SRAECD可能通过与HBV感染患者的T细胞结合抑制T细胞活化,丰富了之前提出SRA负向调控获得性免疫应答的观点。继续深入研究,可能为对乙肝患者开展基于SRA为靶点的免疫治疗研究提供理论依据和策略。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】