骨髓间充质干细胞对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用

发布时间：2019-08-13 19:20

【摘要】： 【目的】 1.建立肠缺血再灌注损伤的动物模型,了解大鼠小肠肠黏膜屏障功能受损后的病理改变。 2.分离、培养、纯化大鼠骨髓源性间充质干细胞,获得足够的间充质干细胞,并对其表面分子进行检测。 3.通过骨髓间充质干细胞移植治疗肠屏障功能障碍的大鼠,评价其对大鼠肠屏障功能的保护作用。 【方法】 1.采用阻断肠系膜前动脉的方法建立肠缺血再灌注损伤的模型:健康雄性SD大鼠,250g-350g,氯胺酮麻醉并固定大鼠,于腹前正中线开腹,分层剪开皮毛、腹肌。找到肠系膜前动脉,以3cm血管夹夹闭45min后开放,恢复血供。在造模后24h处死大鼠,获取小肠病理组织,依据Chiu’小肠组织损伤评价标准对小肠损伤情况进行评分。对照组大鼠仅作假手术。 2.采用全骨髓差异贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞(MSCs):无菌条件下取大鼠双侧下肢股骨和胫骨,剪开骨端,DMEM反复冲洗骨髓腔至骨干发白,将冲洗下的细胞悬液1000rpm离心5min,弃去上清液,用含10%~15%胎牛血清培养液重悬后,接种于75cm2培养瓶,在37℃,5% CO2,饱和湿度CO2培养箱内培养,每天观察细胞生长、贴壁情况。细胞生长至培养瓶面积约90%时传代,根据细胞生长情况1:2或1:3传代。传至第3代时,胰酶消化,收获细胞,流式细胞仪检测。将收获的MSCs分入7个EP管,每管约1×106个细胞,分别为CD29及其同型对照管、CD34及其同型对照管、CD45和CD90及其同型对照管,各管内加入相应标记抗体,避光孵育40min后上机检测。 3.获取雄性SD大鼠的MSCs,传代、增殖、纯化。制作大鼠肠I/R模型。将第3代MSCs用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)标记,荧光显微镜观察标记率。再将MSCs制成细胞悬液,浓度为1×106/ml,于造模成功后60min,通过尾静脉注射到大鼠体内,1ml/只。对照组尾静脉注射等量生理盐水。于输注后6h、24h、72h分批处死大鼠,获取血液、小肠组织等标本。检测血液IL-6、IL-10、TNF-α、MDA、SOD的浓度。小肠组织部分行快速冰冻,荧光显微镜下观察DAPI阳性细胞;部分常规HE染色,观察肠黏膜受损情况;部分作免疫组化,观察肠上皮细胞坏死和增殖修复情况。 【结果】 1.夹闭肠系膜前动脉后,肠系膜动脉搏动消失,肠管变白、痉挛、皱缩,约在40min后肠管鼓胀、呈暗红色,恢复肠系膜前动脉血供后,肠系膜动脉恢复搏动,肠管恢复蠕动,颜色变为鲜红色。小肠组织常规病理镜下观察多数标本肠黏膜破损、溃疡、出血,固有层破坏、毛细血管暴露,中性粒细胞大量浸润,局部出血,甚至有固有层腺体的破坏,肠绒毛萎缩,少数标本病理损伤较轻。Chiu’小肠组织损伤评价标准评分为54.83±4.26分。 2.倒置相差显微镜观察原代接种24h即可见较多细胞贴壁,外观呈纺锤形和多角形, 72h后细胞数量开始增多,细胞形态呈成纤维细胞样长梭形,培养至9d左右细胞汇合达到90%左右,细胞呈极性排列,集落呈漩涡状。经过换液和传代后,细胞逐渐纯化,至第3代时,细胞形态均一,呈膜状铺展。细胞表面标记物经流式细胞仪检测,CD29阳性率为98.6%、CD90阳性率99.6%;而CD34、CD45为阴性,阳性率分别为0.56%、0.89%。 3. MSCs输注治疗组大鼠的血清IL-6、TNF-α水平在治疗后6h和24h显著低于对照组(P0.05);血清IL-10则显著高于对照组(P0.05); MDA水平在各时间点组间都有显著性差异(P0.05),SOD在治疗后24h组间有显著性差异(P0.01)。治疗组小肠组织荧光显微镜下观察可见DAPI阳性细胞。病理及免疫组化显示,治疗组肠黏膜损伤在6h、24h较对照组轻,24h和72h治疗组肠黏膜组织细胞增殖较对照组明显(P0.05)。 【结论】 1.夹闭肠系膜前动脉建立肠I/R模型,可以引起小肠黏膜的坏死、溃疡、出血;模型稳定,适合作为研究对象。 2.全骨髓差异贴壁法能够获得较高纯度的MSCs,获得的第3代MSCs纯度达到95%以上,流式细胞仪鉴定结果为:CD29阳性率98.6%,CD90阳性率99.6%,CD34、CD45为阴性,阳性率分别为0.89%、0.56%,为后续实验提供了充足的MSCs来源。 3.肠I/R I能够引起大鼠全身性炎症反应,于损伤后24h反应较明显,72h逐渐恢复。移植的MSCs能够迁移并定居到受损肠道,对肠I/R I有一定的治疗作用。MSCs能够调节大鼠肠I/R I后引起的全身性炎症反应,抑制炎症介质的过度释放,促进抗炎介质的分泌和氧自由基的清除,减轻肠道的免疫损伤,促进肠上皮的增殖、肠黏膜的修复,维护肠屏障功能的完整性。
【图文】：

表 1-2 I/R 组小肠组织损伤评分表（n=6）编号 6 个视野的评分 总和19 11 7 10 11 10 5827 7 9 10 8 7 48311 8 7 7 14 12 59411 9 7 8 10 8 53510 11 9 9 10 9 58610 10 8 8 7 10 53

表 1-2 I/R 组小肠组织损伤评分表（n=6）编号 6 个视野的评分 总和19 11 7 10 11 10 5827 7 9 10 8 7 48311 8 7 7 14 12 59411 9 7 8 10 8 53510 11 9 9 10 9 58610 10 8 8 7 10 53
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】

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本文编号：2526311