【摘要】：研究背景：结核病是一个全球性的严重公共卫生问题,我国是全球22个结核病高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病(MDR-TB)及广泛耐药结核病(XDR-TB)流行严重的国家之一。因此，结核病的防治形势依然相当严峻。已有研究证实γδ T细胞对结核杆菌抗原的刺激有较强的应答活性，提示γδ T细胞可能与宿主抗结核感染的保护性免疫作用相关。但γδ T细胞参与非特异性或/和特异性抗结核免疫反应的机制并没有完全清楚。产生IL-17的γδ T细胞也可能涉及TB的发病过程。γδ T细胞是受到何种条件和调控机制产生这种炎症性细胞因子IL-17的，这对于了解结核病的发病机制有一定的学术理论意义。通常测定产生IFN-γ的细胞应用的是流式细胞术检测胞内细胞因子产生，其刺激剂为非抗原特异性的PMA+Ionomycin，而具有抗原特异性的Mtb-HAg刺激γδ T细胞产生IFN-γ的测定报道很少。酶联免疫斑点试验（T.SPOT-TB）通过检测IFN-γ浓度反映释放IFN-γ的T淋巴细胞数目，准确判断是否存在结核菌感染，敏感性和特异性较高，但对于检测γδ T细胞产生细胞因子的报道很少。TNF-α是参与结核病的免疫应答及免疫发病过程的一种重要因子，目前已知的研究中关于其在结核感染状态下外周血中的含量研究较少。 目的：检测健康人，TB患者外周血分离成单个核细胞（PBMC）后用非特异性刺激剂（PMA+Iono、PHA）和特异性刺激剂（Mtb-HAg）刺激后，用流式细胞术或ELISPOT方法检测T细胞亚群产生IFN-γ和IL-17以及TNF-α的变化，以描述健康人和TB患者之间γδ T细胞天然性免疫和特异性免疫的差异，为TB患者不同病程阶段免疫功能状态的判定提供新的指标。 方法：1.流式细胞术检测不同刺激剂刺激γδ T细胞后产生IFN-γ和IL-17的细胞 采集健康人外周血，分别用PMA+Iono、Mtb-HAg、Mtb-HAg+IL-23、PHA、PHA+IL-23刺激培养，PMA+Iono刺激培养6小时，其余组刺激培养16小时，每组均加入莫能霉素（Monensin）阻断4小时，收集细胞，加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测产生IFN-γ和IL-17的γδ T细胞比例，同时检测αβ T细胞比例作为对照。 2. ELISOPT检测γδ T细胞不同刺激剂刺激后产生IFN-γ细胞 2.1健康人的外周血分离PBMC后，按10万个细胞/孔种入已包被IFN-γ抗体的孔中，对照组加入PHA、结核杆菌抗原A+结核杆菌抗原B，剩余细胞用免疫磁珠分选出γδ+T后，，通过荧光染色确定细胞数后，按1.5万/孔，3万/孔，6万/孔种入板中，37℃培养20h后洗涤孵育显色，最后检测斑点数计算产生IFN-γ的细胞数。 2.2健康人的外周血分离PBMC后，按10万个细胞/孔种入已包被IFN-γ的孔中，对照组加入PHA、结核杆菌抗原A+结核杆菌抗原B，剩余细胞用免疫磁珠分选出γδ+T后，通过荧光染色确定细胞数后，按3万-5万细胞/孔种入板中，37℃培养20h后洗涤孵育显色，最后检测斑点数计算产生IFN-γ的细胞数。 3.流式细胞术检测不同刺激剂刺激γδ T细胞后产生IFN-γ和TNF-α的细胞 采集健康人和TB患者外周血（或冻存的PBMC），分别用PMA+Iono、Mtb-HAg、PHA刺激培养，PMA+Iono刺激培养6小时，其余组刺激培养16小时，每组均加入莫能霉素（Monensin）阻断4小时，收集细胞，加入荧光标记单抗进行表面分子和胞内染色，流式细胞仪检测产生IFN-γ和TNF-α的γδ T细胞比例，同时检测αβ T细胞比例作为对照。 结果：1.1健康人外周血T细胞经不同刺激剂刺激后，αβ T和γδ T两个亚群均能产生IFN-γ，产生IFN-γ的γδ T细胞比例比产生IFN-γ的αβ T细胞比例要高。其中Mtb-HAg组健康人外周γδ T产生的IFN-γ比例明显高于αβ T细胞，差异有显著性（p0.01）。 1.2健康人外周血T细胞经不同刺激剂刺激后，αβ T和γδ T两个亚群均能产生IL-17。 PMA组、Mtb-HAg组、Mtb-HAg+IL-23组及PHA组，健康人外周γδ T产生的IL-17比例明显高于αβ T细胞，差异均有显著性(p＜0.05）。 2.用ELISPOT方法检测Mtb-HAg刺激外周血γδ T细胞产生IFN-γ斑点的每孔最适细胞数约为30000—50000个γδ+T细胞。 3.1健康人及结核病人外周血T细胞经不同刺激剂刺激后，αβ T和γδ T两个亚群均能产生IFN-γ，产生IFN-γ的γδ T细胞比例比产生IFN-γ的αβ T细胞比例要高。PMA组健康人外周αβ T产生的IFN-γ比例明显高于结核病人组，差异有显著性（p0.05）；PMA组、Mtb组和PHA组健康人外周γδ T产生的IFN-γ比例高于结核病人组，差异有显著性，分别为p0.05，p0.01和p0.05 3.2健康人及结核病人外周血T细胞经不同刺激剂刺激后，αβ T和γδ T两个亚群均能产生TNF-α。 PMA组和PHA组健康人外周αβ T产生的TNF-α比例高于结核病人组，差异有显著性（p0.05）；PMA组和PHA组健康人外周γδ T产生的TNF-α比例高于结核病人组，差异有显著性，分别为p0.05和p0.05。 结论：1. Mtb-HAg刺激健康人外周γδT细胞后产生IFN-γ的细胞显著高于αβ T细胞。 2.健康人γδ T细胞中产生IFN-γ的细胞数均比TB患者的高。 3.健康人γδ T细胞中产生IL-17的细胞数比αβ T细胞中的高。 4.不管是健康人还是结核病人，产生TNF-α的γδ T细胞的比例均高于产生TNF-α的αβ T细胞的比例。 5.通过非特异性刺激剂刺激健康人γδ T细胞中分泌TNF-α细胞的比例高于结核病人γδ T细胞中的比例。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【参考文献】
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1 ;Interleukin 17-Producing γδ T Cells Increased in Patients with Active Pulmonary Tuberculosis[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年03期
2 林小田;谢媛琪;王昱;喻云梅;蔡立莉;姜泓;;肺结核病患者外周血前炎性因子及细胞亚群凋亡的研究[J];华南国防医学杂志;2009年05期
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4 于亮,王梅,马雪银;老年肺结核支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF-α)及白介素-1β的检测及临床意义[J];泰山医学院学报;2002年01期
5 傅瑞全,韦振空;42例结核病患者免疫学指标检测结果分析[J];医学文选;2005年05期
6 陈兰举;张慧洁;陈名武;丁周志;潘家华;李柏青;;外周血T细胞亚群在小鼠结核感染中的意义[J];中国微生态学杂志;2007年03期
7 全国结核病流行病学抽样调查技术指导组;第四次全国结核病流行病学抽样调查报告[J];中华结核和呼吸杂志;2002年01期
8 唐神结,肖和平,范以虎,吴福蓉,张忠顺,李红,杨妍;肺结核患者血清前炎细胞因子及其受体的变化[J];中华结核和呼吸杂志;2002年06期
9 张瑛;孙亚蒙;徐欣晖;吕利雄;;结核感染T细胞斑点试验在结核性疾病中的诊断价值[J];中华临床医师杂志(电子版);2010年12期
10 王爽;杨恩卓;王洪海;沈洪波;;新型抗结核蛋白亚单位疫苗Ag85A-γ干扰素的免疫效果评价[J];微生物与感染;2012年03期
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