神经生长因子（NGF）对神经干细胞的分化以及对神经元轴突形成的影响

发布时间：2019-08-16 17:56

【摘要】： 目的 本实验探讨了神经生长因子(NGF)对体外培养的新生鼠神经干细胞生长和分化的影响,以及神经生长因子对神经轴突形成和生长的作用。 方法 1、材料:2-3天的新生SD大鼠,均由中国医科大学实验动物中心提供。 2、主要试剂:DMEM/F12(1∶1)培养基、B27因子、EGF因子、bFGF因子、NGF因子和Nestin、NSE、GFAP免疫化学试剂盒。 3、实验方法和结果判定:体外分离培养新生SD大鼠神经干细胞。培养过程中通过光学显微镜观察干细胞的生长情况。再通过Nestin、NSE和GFAP免疫组化染色对培养细胞进行鉴定。继续进行分组分化培养(10%FBS组作为对照组,NGF+10%FBS组作为实验组;),分化培养6天后对培养细胞进行NSE免疫组化染色,并对实验组和对照组的NSE阳性细胞数进行计数,求得NSE阳性细胞数。通过对神经元附加同心圆对细胞轴突的数量进行计数。 4、统计学处理:统计学处理采用SPSS统计软件,计量资料以均数+标准差表示,P＜0.01有统计学意义。 结果 本实验结果显示:所培养出的细胞团均为Nestin阳性,诱导分化后均可产生NSE和GFAP阳性细胞。分组分化培养后NGF组中神经元所占比例为12.93±2.4,对照组神经元所占的比例约为5.83±1.7,差异具有统计学意义(P＜0.01)。对两组神经轴突的数量进行分析后,NGF组中单个神经元的轴突数量平均为8.9±0.9,对照组中单个神经元轴突数量平均为3.9±0.2,对两组结果进行统计学分析后,结果具有差异性(P＜0.01)。 讨论 神经干细胞因具有高度自我更新能力、多潜能分化、低免疫原和迁移功能等特性。本次试验通过对不同培养阶段的细胞进行观察,原代培养第二天开始出现细胞克隆团,此细胞团体积不断扩增而且数量也在不断增多。传至第4代时进行单克隆培养,单克隆细胞团经过Nestin免疫细胞化学染色显示均成呈阳性,而且经过分化培养后均能产生NSE和GFAP阳性细胞。这些都表明了所培养细胞是具有高度自我复制能力和分化能力的神经干细胞。对此神经干细胞分组分化培养,并进行细胞计数,计算NSE阳性细胞数的结果显示实验组NSE阳性细胞数明显高于对照组,这一结果也证实了NGF可促进神经干细胞分化为神经元。 本次试验还观察了在神经干细胞向神经元分化过程中NGF对轴突生长的作用,结果显示加入NGF的实验组中的轴突数量远远大于对照组。这说明NGF在神经干细胞向神经元分化过程中,能够促进那些未长出轴突的神经细胞向极化状态转变并增加生长锥的生成,最终增加分化后神经元轴突数量。 通过将本次试验与其它关于NGF促进轴突生长和再生的实验相联系,不难推测:神经元在初期生长出生长锥和轴突的机制与后期轴突出芽、分枝和再生的机制可能基本相同,即使这两个机制不相同,也有一点不可否认,就是这两种机制均能能够被NGF所启动。下一步实验应该进一步研究NGF在此过程中所采用的是什么样的信号传到途径,究竟引发了什么样的具体机制来促进神经元初期轴突的形成和生长,这将对神经干细胞应用于临床有重大意义。 结论 NGF可促进神经干细胞分化为神经元,还可以促进神经干细胞分化的神经元轴突数量的增加。
【图文】：

孔中连续观察5个NSE染色阳性的未与其它神经元助于如图所示的以神经元为圆心的同心圆，分别计数米圆环内的突出数量[7]。将两者均值视为神经元突触验(P<0.05)，比较组间轴突数量有无显著差异。

将单克隆神经干细胞团进行Nestin免疫细胞化学染色，绝大多数细胞均呈阳性反映。细胞团由成百上千个Nestin阳性细胞构成，细胞团周围可见少量的散在的Nestin阳性细胞，，形状多成三角形。(如图3A)。对诱导分化后的细胞分别进行GFAP(如图3B)和NSE染色(如图3C)，均有染色阳性细胞存在。图3，免疫细胞化学染色(X加0)。图3A:神经干细胞团的Nestin染色;图3B:神经干细胞分化后G凡J染色;图3C:神经干细胞分化后NSE染色;三、神经元数量及轴突长度和数量的比较结果诱导分化后第一天可见一定数量的细胞贴壁生长，并可见少量的放射状轴突，继续观察，贴壁生长的细胞不断增多，轴突数量及长度也在不断增长。诱导
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

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本文编号：2527577