TRBP在RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的作用研究

发布时间：2019-09-02 10:36

【摘要】： TRBP全长366aa,属于dsRNA结合蛋白家族,具有3个dsRBD,位于dsRBD2内部的KR-螺旋模序负责RNA结合,第三个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用。1991年,TRBP首先作为HIV-1反式激活应答RNA结合蛋白被分离鉴定出来,它具有多种生物学功能,包括调控精子生成与发育、抑制PKR激活、调节HIV-1基因表达、参与RNAi过程等。TRBP是PKR的强抑制物,它通过直接结合和dsRNA扣押而发挥作用。TRBP不依赖PKR而依赖结构RNA,对翻译也有直接作用。TRBP促进HIV-1的表达和复制,在星形胶质细胞中PKR的高应答导致了HIV-1的低复制和病毒结构蛋白的翻译低下,而TRBP抑制PKR激活,使病毒蛋白产生恢复,从而增强了HIV复制。研究表明TRBP通过对抗PKR介导的抗病毒免疫而在病毒翻译中具有关键作用。 2005年,刊登在Nature和EMBO的两篇文章报道说TRBP与作为RISC组分的Dicer相结合,TRBP、Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中发挥作用。TRBP在dsRNA和Dicer之间募集Ago2时起到桥梁作用, TRBP或Dicer缺失后成熟miRNA产生减少和siRNA功能的丧失,他们推断TRBP募集Ago2到Dicer,将RNAi的启动和执行阶段相偶联。TRBP与RNaseⅢ家族成员Dicer相互作用,并结合dsRNA,随后结合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白,它们共同组成RISC复合体。dsRNA的一条链被递呈给Ago2蛋白从而导致siRISC和miRISC的产生。但是,TRBP哪个结构域在RNAi中发挥作用以及以哪个结构域与Ago2相互作用尚未完全阐明。 为了进一步探讨TRBP与Ago2间的相互作用,我们用PCR方法克隆了TRBP全长基因,构建了只含有两个dsRNA结合结构域的截短/重组基因TAB、TAC和TBC,并克隆入真核表达载体pFlag-CMV4中,经DNA测序,证实获得序列正确,分别命名为pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC。 将pFlag-CMV4-TRBP、pFlag-CMV4-TAB、pFlag-CMV4-TAC和pFlag-CMV4-TBC质粒分别瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞,在转染细胞中检测到了目的基因的表达。各质粒分别转染人宫颈癌HeLa细胞,并稳定建株,裂解细胞通过免疫共沉淀检测TRBP全长及其截短/重组体分子与Ago2、Dicer分子的相互作用,发现全长及各截短/重组体分子均与Ago2、Dicer分子存在相互作用。我们用实时定量PCR和Western blot的方法对细胞系进行了筛选,证实了TRBP在胶质瘤细胞系中低表达。双荧光素检测表明,TRBP低表达的胶质瘤细胞系U251、C6、U87、和SHG44 RNA干扰作用降低。同样,利用干扰β-Actin的siRNA瞬时转染HeLa细胞和U251细胞,发现TRBP低表达的U251细胞干扰作用降低。 综上所述,我们构建了TRBP全长及其截短/重组体真核表达载体,并初步检测了其功能,为进一步研究其功能机制奠定了基础。
【图文】：

第四军医大学硕士学位论文实验材料系细胞系 HeLa、人胶质瘤细胞系 U251, 大鼠胶质瘤细胞系系 U87, 人胶质瘤细胞系 SHG44 为本室保存。与质粒菌 DH5α菌种为本室保存。Flag-CMV4 为本室保存。L3-Hid 由张勇博士构建。

第四军医大学硕士学位论文图4 质粒pGL3-Basic Vector图谱Figure 1. pGL3-Basic Vector circle map.四、主要试剂RPMI 1640 和 DMEM 培养基 Gibco 公司小牛血清 杭州四季青生物制品公司二甲基亚砜（DMSO），， Sigma 公司SuperScriptTMpreamplification system， Gibco 公司Taq DNA polymerase Gibco 公司柱式质粒（小量）纯化试剂盒 上海华舜生物工程公司柱式胶回收试剂盒 上海华舜生物工程公司ConcertTMPlasmid Midiprep Sys
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：2530874