【摘要】： 目的: 建立兔尿道缺损模型,探索脂肪间充质干细胞复合多孔丝素材料修复尿道缺损的可行性。 方法: 1.脂肪间充质干细胞(ADMSCs)分离、培养和纯化: 取兔附睾旁脂肪组织,0.15%Ⅰ型胶原酶消化分离、培养ADMSCs细胞,MTT法测定第3代ADMSCs细胞生长曲线,荧光免疫法测定CD44单克隆抗体、Vimentin单克隆抗体。 2.应用复合ADMSCs的多孔丝素材料修复尿道缺损实验: 选取39只体重约3.0-4.5kg雄性新西兰大白兔,随机分3组进行动物实验:(1)对照组(n=13),(2)多孔丝素材料组(SF组,n=13),(3)BrdU标记的ADMSCs+多孔丝素材料组(SSF组,n=13)。常规麻醉后于尿道腹侧正中线纵行切开尿道前壁1.5cm,切除2.5×1.0cm~2尿道后壁,建立尿道缺损模型。对照组切除尿道后壁,缝合尿道前壁,术后留置导尿3w。SF组切除尿道后壁,将多孔丝素材料用Inlay术式修复尿道缺损后,缝合尿道前壁,术后留置导尿3w。SSF组切除尿道后壁后,将复合BrdU标记ADMSCs细胞的多孔丝素材料用Inlay术式修复尿道缺损后,缝合尿道前壁,术后留置导尿3w。各组动物术后导尿管每天用呋喃西林冲洗一次。术后分批处死动物,收集手术区尿道标本行HE染色常规病理检查,免疫组织化学测定FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3阳性细胞,观察BrdU阳性细胞(SSF组)、巨噬细胞分布情况。所有实验动物手术前和处死前均行尿道造影检查。 主要结果: 1.ADMSCs细胞的分离、培养和纯化: 分离培养2h后,细胞开始贴壁。ADMSCs细胞3d后多呈梭形成纤维细胞样,培养5-7d后,细胞生长可达80%～90%融合,进行传代;第3代ADMSCs细胞形态呈均一的长梭形。常规培养的第3代ADMSCs细胞MTT曲线示第1、2d为缓慢生长期,3d进入对数增殖期,11d进入生长平台期。CD44、Vimentin呈阳性表达。 2.应用复合ADMSCs的多孔丝素材料修复尿道缺损实验: 2.1尿道造影: 所有实验动物术前逆行尿道造影显示尿道形态正常,术后终止实验前复查逆行尿道造影观察尿道狭窄和尿瘘的发生情况。对照组术后并发症发生率为76.92%(7/13),高于SF组的23.07%(3/13)和SSF组的15.38%(2/13),有显著性统计学差异(p0.05)。SSF组和SF组术后并发症发生率无显著性统计学差异(P0.05)。 2.2大体形态学观察: 肉眼观察,对照组术后2w尿道缺损区缺乏内衬黏膜,表面凹凸不平,周围尿道黏膜充血、水肿,术后4w、6w瘢痕已经形成,黏膜收缩,管腔狭窄。SSF组和SF组术后2w手术区丝素材料仍裸露在尿道管腔内侧表面,缺乏内衬黏膜。术后4w、6w丝素表面覆盖黏膜,少量丝素脱落。 组织学观察:对照组术后2w尿道缺损区尿道黏膜上皮未形成,可见大量的淋巴细胞浸润。术后4w缺损区尿道黏膜形成不连续,表面高低不平,黏膜下可见大量淋巴细胞浸润,纤维组织增生。术后6w缺损区尿道黏膜上皮细胞层数增多,细胞排列不规则,极性紊乱。黏膜下仍可见大量淋巴细胞浸润,纤维组织增生,组织结构紊乱,可见散在少量平滑肌纤维。 SF组术后2w多孔丝素表面没有上皮细胞形成,在多孔丝素基底部少量血管、胶原纤维组织生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整,未见降解。术后4w在多孔丝素表面形成复层上皮结构,黏膜下可见血管、平滑肌、纤维组织沿着丝素孔隙生长,丝素中部分组织生长不完全,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整,未见降解。术后6w在多孔丝素表面形成3-4层上皮细胞,黏膜下可见较多血管、平滑肌、纤维组织沿着丝素孔隙生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整,未见明显降解。 SSF组术后2w多孔丝素表面没有上皮细胞形成,在多孔丝素基底部较多的血管、胶原纤维组织生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整,未见降解。术后4w在多孔丝素表面形成3-4层上皮细胞,细胞排列不规则,黏膜下可见大量血管、平滑肌、纤维组织沿着丝素孔隙生长,少量淋巴细胞浸润,丝素结构完整,未见明显降解。术后6w在多孔丝素表面形6-7层上皮细胞,排列规则。黏膜下可见大量的血管、平滑肌、纤维组织沿着丝素孔隙生长,少量淋巴细胞浸润,丝素被分解成小块状。 2.3巨噬细胞和Brdu、FⅧ-RAg、α-SMA、AE1/AE3阳性细胞分布情况: 术后2、4、6w于SSF组和SF组丝素间隙和边缘可见巨噬细胞阳性表达,术后4w于SSF组巨噬细胞阳性数分别为11.66±1.58/HP,较同时间点SF组(13.88±2.08/HP)明显减少,有统计学差异(p0.05) 术后2、4、6w于SSF组丝素材料中可见散在的Brdu阳性的细胞,在丝素材料与尿道相交处较多。 术后2、4、6w于SSF组、SF组、对照组尿道手术缺损区均可见FⅧ-RAg细胞阳性表达。术后4w于SSF组、SF组FⅧ-RAg阳性细胞数分别为23.44±2.40/HP、20.77±2.38/HP,较同时间点对照组(15.11±1.61/HP)明显增多,有显著性统计学差异(p0.01);同时SSF组较SF组明显增多,有统计学差异(P0.05)。 术后2、4、6w于SSF组、SF组、对照组尿道手术缺损区均可见α-SMA细胞阳性表达。术后4w于SSF组、SF组α-SMA阳性细胞数分为33.00±3.27/HP、29.00±3.20/HP,较同时间点对照组(16.11±1.53/HP)明显增多,有显著性统计学差异(P0.01);同时SSF组较SF组明显增多,有统计学差异(P0.05) SSF组与SF组中广谱角蛋白(AE1/AE3)染色阳性,胞浆染成棕黄色,与正常尿道黏膜相似。对照组尿道黏膜与正常尿道黏膜相比,胞浆染成黄色,缺乏尿道上皮复层柱状上皮形态。 主要结论: 脂肪间充质干细胞(ADMSCs)细胞易于分离和体外培养扩增,可作为尿道组织工程的种子细胞。应用脂肪间充质干细胞复合型多孔丝素材料修复尿道缺损具有一定的可行性。
【图文】：
第3代ADMSCs细胞形态（×100）
ADMSCs生长曲线
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329
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本文编号：2532786
