人SLC真核表达载体的构建，表达及其效应研究

发布时间：2019-09-10 15:05

【摘要】： 次级淋巴样组织趋化因子(secondary lymphoid tissue chemokine,SLC)最早发现是一种T细胞特异性趋化因子,对NK细胞和成熟的DC也具有一定的趋化作用。T、NK细胞和DC在机体抗肿瘤免疫中重要的作用。研究表明,缺乏鼠SLC的小鼠T细胞归巢和DC定位发生障碍,次级淋巴组织结构功能紊乱。近期研究发现,SLC受体CCR7表达于初始T细胞、B细胞、DC细胞及黑色素瘤细胞,乳腺癌细胞等多种恶性肿瘤细胞表面,淋巴结部位SLC与其受体CCR7的结合,可促使细胞向淋巴结等次极细胞组织移动,与淋巴细胞归巢有关。因此,SLC及其受体极富潜力成为自身免疫性疾病、移植排斥反应及肿瘤药物设计的新型靶点。本课题组前期研究发现,一定浓度梯度的标准SLC蛋白能够抑制肿瘤生长,并且能够促进外周血淋巴细胞有一定程度的增殖。【目的】据此,本实验采用基因工程技术,构建人SLC真核表达载体,转染MCF-7细胞,检测SLC在细胞中的表达,随后检测其对转染细胞的作用及对PBMC的影响,为进一步研究SLC的作用机制及相关疾病应用研究奠定基础。【方法】 1.人SLC真核表达载体的构建与表达 (1)人SLC基因表达载体的构建及测序以本室已有SLC-RFP为模板,体外PCR扩增基因SLC片断,质粒pgenesil-8、SLC回收产物双酶切后,回收片断进行连接,获得质粒pgenesil-8-SLC,经酶切鉴定及测序分析证实,所克隆和构建的SLC cDNA阅读框及连接部位序列正确; (2)人SLC真核表达载体转染MCF-7及其表达质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,24小时后通过倒置荧光显微镜可观察到细胞内有绿色荧光表达;western blot检测转染细胞24-72小时的培养上清。结果表明,SLC-GFP以分泌型形式表达,并在转染后72小时达到高峰; 2.转染SLC对MCF-7细胞凋亡的影响实验分组 1)空白组:MCF-7 2)转染空载pgenesil8-GFP的MCF-7对照组:MCF-7-vector 3)转染SLC的MCF-7实验组:MCF-7-SLC 采用流式细胞术检测转染的SLC对肿瘤细胞凋亡作用,结果表明转染SLC的MCF-7细胞与未转染SLC及转染空载的MCF-7相比,能显著促进转染细胞的凋亡。 3.转染SLC的MCF-7对PBMC增殖作用实验分组 1)空白对照组:PBMC以培养基刺激 2)MCF-7刺激组:未转染质粒的MCF-7刺激PBMC 3)MCF-7-vector:转染空载体的MCF-7刺激PBMC 4)MCF-7-SLC:转染SLC的MCF-7刺激PBMC 以正常人外周血单个核细胞(PBMC)为反应细胞,以经丝裂霉素C处理的MCF-7、转染空载体的MCF-7及转染SLC的MCF-7作为刺激细胞,不同的刺激细胞分别与PBMC以1:5比例混合培养5天后流式细胞仪检测,结果表明MCF-7-SLC能促进PBMC的增殖。【结论】成功构建pgenesil8-slc-GFP真核表达载体,并证明SLC促进转染细胞凋亡,转染后的MCF-7能刺激PBMC增殖。
【图文】：

重组质粒

14kD标准SLC 浓缩SLC 浓缩SLC图1－2 培养上清中SLC的表达2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM 1 2图1－1 重组质粒pgenesil-8-slc双酶切鉴定M： DL2000 Marker：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp1： pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI2: pGenesil-8-SLC BglII+EcoRI430bp13

转染SLC的MCF-7诱导PBMC的增殖
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.1

【参考文献】