人巨细胞病毒编码蛋白pUL23与宿主细胞蛋白IFP35相互作用

发布时间：2019-09-10 14:28

【摘要】： 目的： 人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因,属病毒US22基因家族成员,编码病毒的皮层蛋白pUL23。目前pUL23蛋白的功能尚不清楚。 我课题组通过酵母双杂交系统筛选了与人巨细胞病毒蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白,其中IFP35蛋白是干扰素诱导蛋白。病毒感染过程会引起宿主免疫系统的反应,包括干扰素的反应,病毒蛋白pUL23与干扰素诱导蛋白IFP35的相互作用,可能与病毒激起宿主的免疫反应有关。为确定病毒蛋白pUL23是否与细胞干扰素途径相关,本课题通过GSTpull-down、免疫共沉淀及共定位等技术进一步确认pUL23与IFP35蛋白之间的相互作用,鉴定pUL23与IFP35相互作用蛋白结构域,以及pUL23与IFP35相互作用的生物学效应。研究成果将为揭示病毒蛋白pUL23的功能奠定基础。方法： 1)pUL23与IFP35相互作用的确认：①酵母双杂交试验：将全长的UL23与IFP35分别构建于pGBKT7及pGADT7载体之上,利用酵母双杂交系统确定此两个蛋白的相互作用；②GST pull-down试验：构建pGEX-4T-1-IFP35载体并将其转化至大肠杆菌表达菌株Tuner(DE3)placI中表达纯化GST-IFP35蛋白,同时将pCDNA3.1(-)-HA-UL23载体转染Cos-7细胞,表达HA-UL23融合蛋白,将此两个蛋白共孵化后,用HA抗体进行Westenblotting检测；③免疫共沉淀试验(Co-IP)：构建pcDNA3.1(+)-IFP35-Flag载体,将其与pcDNA3.1(-)-HA-UL23共转染Cos-7细胞,分别用HA抗体和Flag抗体进行Westen blotting检测；④细胞共定位试验：构建pEGFP-N1-UL23和pDsRed2-C1-IFP35,将其共转染Hela细胞中,采用激光共聚焦显微镜观察蛋白在细胞内的定位情况。 2)pUL23与IFP35相互作用结构域的鉴定：将27个不同长度的UL23短片断分别构建于pGBKT7及pGADT7载体之上,利用酵母双杂交系统来确定pUL23与蛋白相互作用的区域。紧接着将7个不同长度的IFP35短片断分别构建于pGBKT7及pGADT7载体之上,利用酵母双杂交系统来确定IFP35的作用区域。 3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定大分子复合物：pEGFP-N1-IFP35、pCMV-Nmi和pcDNA-HA-UL23分别转染到Hela细胞中,收集蛋白进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,Westen blotting检测结果。 4) Westen blotting检测分子间相互关联：将pcDNA-HA-UL23、pcDNA3.1(+)、pcDNA-IFP35-Flag、pEGFP-N1按一定的质粒用量比例共转染到HEK293T细胞中,Westenblotting检测结果。 结果： 1)酵母双杂交系统,Co-IP, GST pull-down及共定位等四种方法共同证实了pUL23能与IFP35相互作用。 2)通过共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23与IFP35共定位于细胞质,并处于细胞核周边。 3)pUL23相互作用的重要区域在594-624bp之间,IFP35相互作用的重要区域在80-268aa之间,即两个串联的NID结构域。 4)Nmi、IFP35、pUL23三者在Hela细胞中能形成一个大小约为300-400kDa的高分子聚合物。 5)在HEK293细胞中,随着pUL23表达量的增加,IFP35表达量仅有微量的增加,IFP35的表达量影响pUL23的表达量,随着IFP35表达量的增加,pUL23表达量明显增加。结论： 本课题运用酵母双杂交、Co-IP、GST pull-down及细胞共定位四种不同的实验技术确定HCMV pUL23与宿主蛋白IFP35相互作用。实验数据显示病毒蛋白pUL23与IFP35共定位于细胞质中,位于细胞核周边,pUL23与IFP35的NID结构域相互作用。在细胞内,pUL23和IFP35与另一个干扰素调控过程中重要蛋白Nmi形成大分子复合物,并且pUL23在细胞内的表达量与IFP35的表达量有关。以上实验结果提示了病毒蛋白pUL23与宿主细胞干扰素途径相关的分子之间存在密切的关系,为进一步研究病毒蛋白pUL23与宿主细胞免疫系统相关性提供了有力的证据。
【图文】：

图1HCMV病毒结构Fig.1ThestruetureofHCMVvirion呈球形，直径约为200nln[3]，病毒颗粒由外到内主要由包膜(enve)、核衣壳(nueleoe叩sid)组成(如图l)。病毒颗粒的最外层

图2IFP35的结构图Fig.2Thes加ctureofIFP35亮氨酸拉链基序是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基其它疏水性氨基酸，(亮氨酸是疏水性氨基酸)，在第8个氨基酸处形成
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R373

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本文编号：2534075