黄曲霉毒素B1单克隆抗体和单链抗体的制备

发布时间：2019-09-16 00:20

【摘要】： 黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是黄曲霉毒素中毒性最强的一种毒素,国际上以黄曲霉毒素的毒性作为10,000的基准,来比较其它物质的毒性。黄曲霉毒素的危害性主要表现为强烈的毒性和致癌性,由于它在花生、玉米等食品中广泛存在,因此严重危害了人们的身体健康。在现代社会里,随着人们生活水平的提高,人们日益关注食品安全问题,食品安全已引起各国政府的严重关注,欧盟在2000年就提出了世界上最严格的安全标准和检验标准,其中AFB1为2μg/kg,总黄曲霉毒素为4μg/kg。因此,也形成了新贸易壁垒,对我们国家的农产品出口造成了重大的经济损失。 本研究以AFB1-BSA免疫小白鼠,经过三次免疫以后,用间接ELISA法检测小鼠血清,选取血清效价高达16000的小鼠,在四免后取效价最高的小鼠的脾脏细胞,利用50%PEG4000将其与SP2/0细胞进行融合,制备杂交瘤细胞。经过对培养上清的筛选和杂交瘤细胞的克隆化,最终得到能分泌黄曲霉毒素B1抗体的杂交瘤细胞株0G9。再将单克隆杂交瘤细胞系提取RNA,经过RT-PCR获得抗体可变区基因,利用一柔性肽段(Linker)连接形成单链抗体(single chain fragments variable,scFv),后应用基因工程方法,将scFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E连接,转化大肠杆菌TG_1,获得单链抗体噬菌体文库和利用噬菌体展示(Phage display)技术对抗体库进行了4轮淘选(panning),获得了AFB1特异性的单链抗体,为进一步的抗体工程奠定了基础。
【图文】：

此不需要通过提纯总RNA制备mRNA。用合成的cDNA做模板，使用在前面列出的对应的通用引物，分别扩增出重链可变区VH和轻链可变区vL。然后进行1%琼脂糖凝胶电泳。扩增结果如图3一3所示，其中重链Vl、大约是340如，轻链vL大约是325bp，与理论值相符。3.4.3:cFv基因的扩增与组装本试验通过一条灵活的多肤连Linke:将重链VH与轻链VL连接起来组装成ScFv基因。在PcR体系中，通过重叠延伸拼接反应(SOE)，组装成VH一Linker一VL或者VL一Linker一vH。然后以此作为模板，加入上游与下游带有酶切位点的对应的引物，特异性进行扩增scFv基因。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，试验结果如图3一4

3.4.4pQYI.s质粒双酶切pQYI.5质粒经Notl和胡I双酶切后，切掉750bP大小的片段，胶回收大片段，得到载体 pCANTABSE，然后与双酶切后的scFv进行连接(如图3一5)。3.4.5噬菌体抗体库的构建及噬菌体展示将切胶回收得到的scFv用动I和Notl酶切，，由于动I和Notl酶切条件不一致，故分开来切。先50℃用动I酶切4h，酶灭活后再用 Not137℃酶切4h，最后乙醇沉淀回收。定量后与同样双酶切的载体pCANTABSE以摩尔比3:1的比例16℃连接过夜。为了扩大库容，连接10管，每管20林L体系，连接过夜后用乙醇沉淀，再溶于总体积10~20两的超纯水中。其载体构建如图3一6。图3一5质粒pQYI.5双酶切图Fig3一 5ThedoubledigestionofPQYI.51
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【引证文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 才琳;抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体和单链抗体的制备及活性研究[D];黑龙江八一农垦大学;2010年

2 王莹;同时检测多种真菌毒素的生物芯片技术研究[D];华中农业大学;2012年

本文编号：2536012