hmSD沉默对PC-3细胞增殖迁移影响的体外研究

发布时间：2019-09-15 20:29

【摘要】： 目的:构建表达pGCsi-hmSD质粒,转染前列腺癌PC-3细胞,观察沉默hmSD基因对PC-3细胞增殖,迁移能力及MMP-2 mRNA表达的影响,为前列腺癌的基因治疗提供靶向参考。 方法:RT-PCR检测hmSD mRNA在PC-3细胞系的表达;以基因重组技术构建表达pGCsi-hmSD质粒,应用真核细胞转染技术转染前列腺癌PC-3细胞并检测转染效率;PC-3细胞转染pGCsi-hmSD质粒后,RT-PCR检测hmSD mRNA表达的变化,倒置显微镜观察细胞形态的变化,MTT检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡的改变;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的变化,RT-PCR检测转染pGCsi-hmSD质粒PC-3细胞MMP-2 mRNA表达的改变。 结果:1.经限制性酶切鉴定及DNA序列测定证实,成功构建了pGCsi-hmSD质粒;2.PC-3细胞转染效率各组均大于50%,且各组转染效率没有差异。3. PC-3细胞转染pGCsi-hmSD质粒后, RT-PCR检测hmSDmRNA表达水平降低,倒置显微镜下观察细胞数目减少,皱缩,MTT实验结果表明细胞增殖受抑制,流式细胞术结果表明其促进细胞凋亡。4.划痕实验和Transwell实验结果为PC-3细胞转染pGCsi-hmSD质粒后细胞迁移能力降低,RT-PCR结果显示MMP-2 mRNA表达下降。 结论: 1.成功构建了pGCsi-hmSD质粒,可特异性沉默PC-3细胞的hmSD表达。2.hmSD能够促进PC-3细胞的增殖,抑制肿瘤细胞凋亡。3. hmSD-RNAi可降低PC-3细胞的迁移能力,可能与抑制MMP-2 mRNA表达有关。
【图文】：

图1 pGCsilencer-U6/Neo/GFP质粒图谱剂的配制IMDM培养液：1000ml去离子水中加入IMDM 17.、链霉素各 10 万单位。过滤除菌，，4℃保存。PBS 缓冲液(pH7.4)： 1000ml 去离子水，加入氯化 0.2g，磷酸氢二钠 1.56g，氯化钾 0.2g。高压灭胎牛血清：已灭菌胎牛血清分装,-20℃保存。细胞冻存液：IMDM 培养液中加入 20%胎4℃保存。MTT 的配制：称取 50mg 的 MTT 溶于 10mlPBS 或色瓶中，4℃保存备用。细胞消化液：以 PBS 液配制，胰蛋白酶 0.25%；ED

2 hmSD mRNA在PC-3细胞系的表达核重组质粒的构建及鉴定模板寡核苷酸的设计设计原则，从 GeneBank(NM00665的靶序列, 并用 RNA structure4.2 预 测 , 最 终 确 定 了 三 条 DNA 寡1 针 对 其 编 码 区 130-151 位 2 针 对 其 编 码 区 220-241 位 3 针对其编码区 839-860 位碱基序列Ⅰ酶切位点和反向的两个一致的靶序列个非同源序列(TTCAAGAGA)所间隔。3′位点。预测 siRNA 靶序列二级结构如
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

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本文编号：2535890