自杀质粒同源重组方法构建弗氏志贺菌htrA可控表达菌株

发布时间：2019-09-17 10:21

【摘要】：目的构建弗氏志贺菌Htr A蛋白的可控表达菌株。方法构建自杀质粒同源重组载体,利用重组方法在基因组htr A前插入阿拉伯糖启动子,同时构建并导入外源表达Ara C蛋白的表达载体,实现对Htr A蛋白的可控表达;在此基础上,通过蛋白印迹实验,检测诱导前后全菌以及周质中Htr A蛋白的表达情况。结果测序结果表明,自杀质粒同源重组载体以及外源表达载体构建成功;蛋白印迹实验结果显示,对比阿拉伯糖诱导菌株,未诱导菌株中基本未检测到Htr A蛋白的表达。结论自杀质粒同源重组方式可在无阿拉伯糖时有效阻遏Htr A蛋白的表达;同时在诱导后,还可恢复Htr A蛋白的正常表达,有利于后续功能研究。
【图文】：

示意图,同源重组,示意图,周质

rA重组载体，将araC连入pACYCl84载体中构建pACD-araC重组载体;连接产物各自转化入E．coliDH5α和S17感受态中，挑选单克隆DH5α/pACD-araC和S17/pGD-htrA，振荡培养并提取质粒。PCＲ验证正确后送至明琛志远公司测序。1．3可控表达株的构建振荡培养DH5α/pACD-araC和S17/pGD-htrA菌株并提取质粒。取5μlpACD-araC质粒电转入已制备的301感受态细胞中，挑取单克隆，传代后制备301/pACD-araC感受态细胞并将5μlpGD-htrA质粒电转入其中，利用Amp、Cm双抗性筛选阳性克隆，振荡培养并利用PBADa/htrAP2引物进行PCＲ验证(图1)。图1自杀质粒pGD-htrA同源重组示意图1．4全菌蛋白的制备将电转制备的301/pGD-htrA/pACD-araC菌液置于37℃振荡培养，其中不加阿拉伯糖诱导为HtrA沉默株，加阿拉伯糖诱导为HtrA诱导表达菌株。培养至对数中后期(约7．5h)收集菌体，加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，13000r/min离心2min，取上清液即为全菌蛋白样品。1．5周质蛋白的制备［7］转接301/pGD-htrA/pACD-araC阿拉伯糖诱导与未诱导菌株菌液于37℃培养至对数中后期(7．5h)，6000r/min离心8min收集菌体，用1×PBS洗2次后加入100μl裂解液(20%蔗糖，30mmol/LTris-Cl，pH8．0，1mmol/LEDTA，1mg/ml溶菌酶)重悬菌体，冰浴中轻轻振荡15min，6000r/min离心15min，收集上清即为周质蛋白。加入2×SDS上样缓冲液，煮沸10min，13000r/min离心2min，制备周质蛋白样品。1．6Western印迹检测将已制备的全菌蛋白以及周质蛋白样品进行SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上;用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，用TBST1∶1000稀释的HtrA抗体室温孵育，，轻摇1h后TBST洗膜3次，每次5min;用TBST1∶5000稀释的羊抗鼠单克隆抗体室温孵育，轻摇1h后TBST洗膜3次，每次5min，用化

DNA标志,标志物,周质,阿拉伯糖

图2PCＲ扩增PBADa-htrA100(A)和araC(B)目的基因A:M．Trans2KplusⅡDNA标志物;1．PBADa-htrA100目的基因;B:M．DL2000DNA标志物;1．araC目的基因2．2自杀质粒同源重组菌株构建取5μlpACD-araC质粒电转入已制备PBADa-htrA100目的基因的301感受态细胞中，挑取单克隆，传代后制备301/pACD-araC感受态细胞并将5μlpGD-htrA质粒电转入其中，利用Amp、Cm双抗性筛选阳性克隆，初步验证自杀质粒pGD-htrA已重组到301基因组上。进一步利用引物PBADa与htrAP2进行PCＲ扩增(图3)，最终证明自杀质粒靶向地与301基因组上的htrA基因重组，顺利插入到htrA基因中，成功在基因组水平上将htrA基因上游加入阿拉伯糖启动子，可以进行诱导表达。图3自杀质粒同源重组成功菌液的PCＲ验证M．Trans2KplusⅡDNA标志物;1．301-pGD-htrA/pACD-araC菌液;2．301/pACD-araC阴性对照2．3Western印迹检测自杀质粒同源重组方法缺失htrA制备htrA沉默表达菌株以及诱导表达菌株的全菌蛋白和周质蛋白样品，进行SDS-PAGE，Western印迹检测HtrA蛋白的表达情况。利用自杀质粒同源重组构建的301/pGD-htrA/pACD-araC加入阿拉伯糖诱导时，HtrA抗体在相对分子质量约50×103处检测到明显特异性条带，而与之相对应的无阿拉伯糖诱导时，同等位置没有明显条带(图4A)。在提取的周质蛋白中，加入阿拉伯糖诱导时，周质中HtrA抗体在50×103附近检测到明显特异性条带，而无阿拉伯糖诱导时，周质中未检测到HtrA的存在(图4B)。这说明自杀质粒同源重组的方式可以高效地敲低HtrA蛋白的表达，同时又可以通过阿拉伯糖诱导的方式使其表达。图4SDS-PAGE检测301/pGD-htrA/pACD-araC菌株的全菌蛋白(A)和周质蛋白(B)3讨论革兰阴性致病菌志贺菌属，具有极强的传染性和致病性。HtrA蛋?
【作者单位】：军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81171531,81125012,81373316) 国家973计划资助项目(2011CB504901,2013CB910804)
【分类号】：R378.25

【共引文献】