IPS-1基因缺失突变体对IFN-β诱生作用及其抗HSV-1作用的影响

发布时间：2019-09-18 09:58

【摘要】： 目的:构建缺失300-444位氨基酸的干扰素β启动刺激因子1(Interferon beta promoter stimulator 1, IPS-1)的突变体基因(△IPS-1基因)及其重组质粒pEF-BOS-FLAG/△I PS-1,通过体外细胞实验初步研究△I PS-1对IFN-β诱生作用及其抗HSV-1作用的影响,进而确定该部位对IPS-1发挥正常功能的作用,为进一步探索IPS-1蛋白的生物学活性提供实验依据。方法:以含有IPS-1目的基因的重组质粒(pEF-BOS-FLAG/IPS-1)为模板,用Primer5.0软件设计引物,通过重叠延伸PCR法获得缺失300-444位氨基酸的△I PS-1基因,经酶切纯化后将△I PS-1基因克隆至pEF-BOS-FLAG真核表达载体;阳性克隆经双酶切及测序鉴定。采用磷酸钙体外转染至HEK293T细胞株,经Western-blot检测其表达;分别用IPS-1及△I PS-1刺激细胞后,ELISA检测不同时间点细胞培养上清中IFN-β分泌量;用不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)的HSV-1病毒感染分别转染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1、pEF-BOS-FLAG/△I PS-1质粒的HEK293T细胞,氨基黑染色法检测不同组别中细胞感染病毒后的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE);噬菌斑检测各转染细胞组不同时间段细胞上清的病毒滴度。结果:成功构建了△IPS-1基因及pEF-BOS-FLAG/△I PS-1真核表达载体,双酶切鉴定及测序结果显示目的片段与△I PS-1基因序列完全一致;将真核表达载体pEF-BOS-FLAG/△I PS-1及pEF-BOS-FLAG/IPS-1分别转染HEK293T细胞,48h后进行Western-blot鉴定,可分别检测到分子量约为44.2kD和58.8kD的蛋白条带,与预期的△IPS-1及IPS-1大小一致。pEF-BOS-FLAG/△IPS-1、pEF-BOS-FLAG/IPS-1转染组细胞培养上清中不同时间段IFN-β的分泌量明显高于空白对照组(P0.001);与转染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1重组质粒细胞组相比转染了pEF-BOS-FLAG/△IPS-1重组质粒细胞组在不同时间段其IFN-β分泌量均有明显减少,两组相比有统计学差异(P均0.05)。氨基黑染色测定结果显示:转染了pEF-BOS-FLAG/△I PS-1重组质粒的细胞组中发生CPE的细胞比例高于pEF-BOS-FLAG/IPS-1重组质粒转染的细胞组。病毒滴度检测结果表明转染了pEF-BOS-FLAG/△I PS-1重组质粒的细胞上清中病毒滴度高于转染了pEF-BOS-FLAG/IPS-1重组质粒组,且两组病毒滴度均低于空白对照组。结论: (1)构建了IPS-1基因缺失300-444位氨基酸的△I PS-1基因及重组质粒pEF-BOS-FLAG/△IPS-1。 (2)缺失300-444位氨基酸的△IPS-1与IPS-1相比能使HEK293T细胞IFN-β分泌量明显减少,△IPS-1不能完全抑制HSV-1感染细胞产生的细胞病变效应,该突变体抗HSV-1病毒作用明显减弱。
【图文】：

分析图,突变体,琼脂糖电泳,基因

IPS-1 基因 PCR 产物琼脂糖电；2：PCR 产物 AD（△ I PS-1tic analysis of PCR product 1.0% agarose geloduct of AD fragment（ △I PS-1切鉴定及 PCR 鉴定用 XbaⅠ和 ClaⅠ双酶切后接，转化感受态 E.coli DH5裂解法抽提重组质粒，用的片段。用抽提的重组质粒图 4）。

重组质粒,酶切鉴定,PCR鉴定,质粒

变体 IPS-1 基因 PCR 产物琼脂糖电泳对照；2：PCR 产物 AD（△ I PS-1 基horetic analysis of PCR product of nt) by 1.0% agarose gelR product of AD fragment（ △I PS-1 ge酶切鉴定及 PCR 鉴定产物用 XbaⅠ和 ClaⅠ双酶切后，向连接，转化感受态 E.coli DH5α 受，，碱裂解法抽提重组质粒，用 Xbabp 目的片段。用抽提的重组质粒 DN段（图 4）。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392.1

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