pvdQ基因在人肠道上皮细胞中的表达作用以及对铜绿假单胞菌致病性影响的研究

发布时间：2019-09-18 22:18

【摘要】： 目的：观察铜绿假单胞菌Quorum sensing (QS)系统信号分子3OC12-HSL对人肠道上皮细胞系Caco-2活力及细胞凋亡的影响作用及其深入机制。构建铜绿假单胞菌酰基酶编码基因pvdQ的真核表达载体,并检测其在肠道上皮细胞中的表达及其表达对3OC12-HSL分子的抵御作用。方法：利用不同浓度3OC12-HSL (100-300uM)分别干扰Caco-2细胞4小时后,采用MTT法检测Caco-2细胞干扰前后细胞活性的变化及利用流式细胞术检测细胞凋亡变化,并使用western blot方法检测Caco-2细胞中凋亡相关蛋白p38/MAPK及NFκB表达变化。构建pvdQ基因真核表达载体并使其在Caco-2细胞中表达。用3OC12-HSL分子干扰表达pvdQ基因的Caco-2细胞,利用3OC12-HSL分子感应菌株E.coli MG4检测干扰前后Caco-2细胞上清液中3OC12-HSL分子活性变化,利用质谱分析仪检测干扰前后Caco-2细胞上清液中3OC12-HSL分子浓度变化,同时利用流式细胞术检测3OC12-HSL分子对表达pvdQ基因Caco-2细胞凋亡的影响作用。结果：MTT结果显示,3OC12-HSL分子能抑制Caco-2细胞活性(P0.05),流式细胞术结果表明,3OC12-HSL能促进Caco-2细胞发生细胞凋亡(P0.05),且呈剂量依赖性。同时,western blot结果显示,3OC12-HSL分子干扰细胞后,p-p38/MAPK及NFκB蛋白表达水平增加。pvdQ基因真核表达质粒转染Caco-2细胞后,利用western blot方法检测到(?)PvdQ在Caco-2细胞中表达,感应菌株E.coli MG4检测结果表明,pvdQ基因在Caco-2细胞中表达能有效减弱Caco-2细胞上清液中3OC12-HSL活性。质谱分析结果表明,pvdQ基因能降低Caco-2细胞上清中3OC12-HSL分子浓度,且呈时间依赖性(P0.05)。流式细胞术结果表明,pvdQ基因在Caco-2细胞中表达可抵御3OC12-HSL分子促进Caco-2细胞凋亡的作用。结论：铜绿假单胞菌QS系统信号分子3OC12-HSL能抑制肠上皮细胞Caco-2细胞活性,促进细胞发生凋亡,其机制可能与3OC-12-HSL分子调控凋亡相关蛋白p38/MAPK及NFκB蛋白表达相关。成功构建带有铜绿假单胞菌pvdQ基因的真核表达质粒pIRES2-EGFP-pvdQ,并转染入人肠道上皮细胞Caco-2, pvdQ基因在Caco-2细胞中表达能协助Caco-2细胞降解其周围的3OC12-HSL并抵御3OC12-HSL所引起的细胞凋亡作用。
【图文】：

模式图,系统调节,模式图,铜绿假单胞菌

图1.AHL介导的Qs系统调节模式图Figure1.AHL一mediatedQS一dePendentregulationofmultiPletarget30C:2一HSL异代厂几…丫人丫。H6C4一HSL图2.铜绿假单胞菌Qs信号分子结构图Figure2.ChemiealstruetureofQSsignalmoleeules(30C12一HSroducedbyPaeruginosa

活性抑制,意义,对照组,浓度

30C12一 HSL300pM组20.68士0.31%。不同浓度30C12一HSL(100pM，，200林M， 300pM)药物组和对照组(DMSO组)之间差异有显著性意义(P<0.OS)。并且30C12一HSL对Caco一2细胞活性抑制率和其浓度呈正比(图3)。 22251一’一—--二刁刁~~~20r一————~一-—一州目首司司恋恋_}}口口 }}}、、，151一——一一--—~-—一一—~一一一翻.圈r一月月彗彗{.西‘.口 .1111鬓鬓‘井富干畜警葡葡 DDDMSO100uM200uM300u从从图3不同浓度30C12一 HSL(100pM， 200pM，300pM)干扰Caco一2细胞4小时后对Caco一2细胞活性的抑制Fi乡汀 e3Irlhibitionof30C12一HSL(10opM，200pM，300pM)toeytoactiveofCaco一2eells-佃~~~.尸一一一一--一一一l9
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】