HPV6型L2E7E6融合蛋白治疗性疫苗的原核表达及其免疫效果评价

发布时间：2019-09-20 00:17

【摘要】：人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)是重要的传染性致病因子,可引起人体不同部位皮肤和粘膜的增生性疾病及恶性肿瘤。根据其致病性的不同,可分为低危型别和高危型别,高危型别与宫颈癌密切相关,低危型别则与皮肤生殖器疣相关。生殖器疣(Genital Wart, GW)是目前世界上最流行的性传播疾病之一。虽然GW一般不会导致死亡,但是会使患者产生心理阴影,并带来昂贵的治疗费用。GW与HPV感染的密切关系早已明确,其中以HPV-6、11型为主。目前治疗GW的常见方法有物理疗法(如冷冻、激光等)和药物治疗,虽然见效快,能在短时间内清除疣体,却不能彻底清除肿瘤细胞或被病毒感染的细胞,故极易复发。这就需要寻找更为有效的预防和治疗GW的方法。 HPV疫苗可分为预防性和治疗性疫苗。目前预防性疫苗已取得了重要进展,Merck和GSK公司的HPV预防性疫苗已经上市,其主要策略集中在诱发出针对HPV衣壳蛋白L1的相关构象依赖表位的高滴度中和抗体来预防感染；治疗性疫苗的研究进展则相对缓慢,其主要机制是通过诱发机体产生针对病毒抗原的细胞免疫反应,从而清除肿瘤细胞或被病毒感染的细胞。由于HPV早期蛋白E6、E7在病毒生活周期中持续存在,已经成为当前多数治疗性疫苗选择的靶抗原。针对高危型别的HPV16/18型治疗性疫苗已进行了较多的Ⅱ期临床研究,并获得一定的治疗效果；而针对低危型别的研究较少,只有GSK公司一家研制的HPV6型L2E7融合蛋白治疗性疫苗进行了Ⅱ期临床,对仅感染HPV6型的GW有一定的治疗效果。本论文的设计思路是：在HPV6型L2E7融合蛋白的基础上,加入近年来临床研究中发现的具有更强免疫原性的E6蛋白,构建L2E7E6融合蛋白。考虑到全长L2与E7、E6基因融合可能影响蛋白的表达水平,选择将5’端360bp,600bp和全长3种不同长度的L2基因片段与E7、E6基因进行融合。利用IFN-γELISPOT.ELISA.HPV6型假病毒中和试验来比较各融合蛋白的细胞和体液免疫效果,筛选一种融合蛋白对其免疫指标进行进一步的细化评价,包括相关T细胞表位的筛选及亚型的确定。主要研究结果如下： 1.构建了HPV6型L2、E7、E6基因的原核表达质粒,表达并纯化了His-6L2、GST-6E7、GST-6E6蛋白,纯化后的蛋白能用于相应抗体水平的ELISA检测。 2.构建了HPV6型L2的3种不同长度基因片段与E7、E6基因融合的原核表达质粒,表达、鉴定并纯化了6L2360E7E6、6L2600E7E6蛋白。动物免疫及效果评价结果显示,2种蛋白在CpG佐剂作用下均能在C57BL/6小鼠体内诱发强的细胞免疫反应,但2种蛋白免疫效果之间没有统计学差异,针对同型假病毒的中和抗体滴度均为1：2560。 3.选择原核表达水平较高的6L2360E7E6蛋白做进一步的免疫效果评价。在细胞免疫方面,6L2360E7E6+CpG佐剂最优,其次是6L2360E7E6无佐剂组,6L2360E7E6+Al(OH)3佐剂弱；ELISA结果显示,各组IgG抗体水平无显著差异；假病毒中和实验结果显示,6L2360E7E6+CpG诱发的针对HPV6、11、16、18、58、45型假病毒的中和抗体及交叉中和抗体滴度分别为1：3200、1：1600、1：800、1：800、1：200、1：800；小鼠肿瘤生长抑制实验结果显示,6L2360E7E6+CpG佐剂能明显延迟肿瘤细胞的成瘤时间并抑制肿瘤生长,且有部分小鼠肿瘤生长得到完全抑制。 4.分别筛选出了C57BL/6小鼠HPV6型E7、E6蛋白反应最强的E71_15和E637-51肽段,位于其中的T细胞表位均为8肽,具体氨基酸序列分别为N'-VTLKDIVL-C'和N'-YSYAYKHL-C'；胞内细胞因子染色实验结果证实二者均为CD8+亚型T细胞表位；同时,小鼠体内CTL实验结果显示E637-51肽表位是强的CTL表位。综上所述,本研究获得了能在原核表达系统高效表达的HPV6型L2360E7E6融合蛋白,该融合蛋白在C57BL/6小鼠体内能诱发强的CD8+T细胞免疫和体液免疫反应,可作为HPV6型慢性感染及相关生殖器疣治疗的候选疫苗。
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】