间接包被ELISA法检测血清游离β-HCG方法学研究

发布时间：2019-10-07 23:12

【摘要】： 目的 1.建立间接包被ELISA (enzyme linked immunosorbent assy,酶联免疫吸附试验)检测血清游离β-HCG (free-β-huaman chorionic gonadotropin,F-β-HCG)检测方法。 2.探讨降低ELISA试验中非特异反应的方法。 3.评估游离β-HCG检测在相关疾病诊疗中的意义。方法 1.间接包被ELISA法检测血清游离β-HCG方法学建立(1)BBC酶标反应板的制备,(2)抗游离β-HCG单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的生物素化, (3)辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)过碘酸钠法标记抗游离β-HCG多克隆抗体(polyclonal antibody, pAb),(4)间接包被ELISA法检测血清游离β-HCG方法学建立及评价。 2.降低ELISA中非特异显色方法学探讨(1)更换标准品稀释液,(2)用连接有包被抗体的亲和层析柱提纯酶标抗体,(3)在酶标抗体中加入包被抗体的Fc段3.血清游离β-HCG与相关疾病的临床研究(1)血清游离β-HCG检测对正常妊娠与异位妊娠的诊断意义,(2)血清游离β-HCG检测在妊娠滋养细胞疾病中的临床意义。结果 1.间接包被ELISA法检测血清游离β-HCG方法学建立：通过对该方法中各种反应条件的优化,确定了最适工作条件：生物素抗体和酶标抗体的最适工作浓度分别为1：1000和1：12000,本检测方法具有较好的稳定性,灵敏度0.1ng/ml,回收率95.92%～102.51%,批内差异7.54%～11.12%,批间差异12.51%～18.11%,与FSH、TSH、LH、α-HCG的交叉反应率0.1%,检测范围0.1～500ng/ml,与进口试剂盒的相关性尚可(r2=0.7892)。 2.降低ELISA中非特异显色方法学探讨：结果显示,更换标准品稀释液和用连接有包被抗体的亲和层析柱提纯酶标抗体两种方式对本方法不适用,而向酶标抗体中加入包被抗体的Fc段在本实验中效果显著。 3.血清游离β-HCG与相关疾病的临床研究：正常妊娠孕妇血清游离β-HCG水平明显高于异位妊娠患者(p0.05),妊娠滋养细胞疾病患者血清游离β-HCG水平明显高于正常妊娠孕妇(p0.05)。结论 1.本文研制的间接包被检测血清游离β-HCG方法,引入了生物素-亲合素系统,提高了抗体利用率,在很大程度上降低了“钩状效应”的产生,且灵敏度高、特异性好,具有较好的稳定性和检测范围,适于临床应用。 2.本文探讨了三种降低ELISA中非特异显色的方法,均具有一定的应用价值,尤其在酶标抗体中加入包被抗体的Fc段的方法,目前国内尚无相关报道,有待进一步研究。 3.血清游离β-HCG的测定为异位妊娠、妊娠滋养细胞疾病等的诊断提供重要依据。
【图文】：

ProtainA纯化抗F一p一HCGmab

凝胶柱

1.1.2.3酶标抗体的标记1.1.2.3.1实验原理:经典的过碘酸钠(NaIO4)法，需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的a和。氨基以避免酶分子之间的交联。后来wilson等改用在低pH下使用NaIO4活化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP的步骤。HRP经NalO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH‘(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标一记抗体。酶与抗体结合后，根据分子筛原理，可用SePhadexGZoo凝胶将酶结合物与游离的酶及抗体分开。1.1.2.3.2实验方法(l)HRp的活化:称取20mg的HRP，溶于1omM(pH7.4)的醋酸钠溶液中，终浓度为Zomg/ml。在酶中加入17oulo.ZM的Nalo4，边加边搅拌，室温避光反应15min。再加入0.sml乙二醇，室温避光搅拌smin，以终止反应。(2)HRp的脱盐:将SephadexG25凝胶预处理后装柱。用10倍体积0.3M的pHg.5碳酸盐缓冲液平衡柱体。将处理过的HRP上样，收集洗脱液颜色最深的部分(图2)，，此过程主要目的为脱盐。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392.7

【参考文献】