内毒素休克小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组学研究

发布时间：2019-10-13 07:50

【摘要】：脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应征候群,其严重并发症—感染性休克(septic shock)是创伤、烧伤和手术后病人最主要的死亡原因之一。统计表明,临床半数的脓毒症是由于革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)感染引起的,革兰氏阴性菌的细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或称为内毒素(endotoxin),被认为是革兰氏阴性菌引起脓毒症的主要作用分子。LPS广泛作用于机体多种组织器官,其中内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞,在LPS的刺激下,它们产生大量的细胞因子,即“细胞因子风暴”(cytokine storm),进而引起失控性的炎症级联反应,最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍(mutiple organ dysfunction syndrome,MODS)。肝脏是体内物质和能量代谢中心,也是感染性休克最易受损的器官之一。研究表明:脓毒症时肝细胞线粒体功能损失是肝脏受损的主要原因之一。脓毒症时线粒体基质钙超载,大量氧自由基释放,NO的生成增多,以及各种细胞因子的直接或间接性损伤作用,使得肝细胞线粒体结构改变,代谢功能障碍,导致肝细胞凋亡,进而出现肝功能障碍和肝衰竭。 LPS信号转导通路的启动是内毒素致病过程中的重要环节。细胞信号转导研究的中心问题就是细胞感受、转导环境刺激,调节代谢生理反应和基因表达的分子途径。磷酸化修饰本身所具有的简单(simplicity)、灵活(flexibility)、可逆(reversibility)的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段,蛋白质磷酸化在信号转导中所起的无可替代的作用已是人所共知的事实。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、肿瘤发生等过程在内的所有生命活动,目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。那么,内毒素休克早期究竟线粒体发生了哪些功能事件?其具体分子机制如何?目前所知甚少。因此,进行内毒素休克时肝细胞线粒体中大规模磷酸化蛋白质组学分析对研究内毒素休克的发生发展机制是十分重要的。以往的研究大多是在已有的工作基础上对少数几个细胞分子进行分析,在理论上推导出对疾病发生发展可能具有重要意义的分子,进而进行深入细致的功能研究。这是一种传统的研究策略,其优点是研究问题集中,容易深入,可以比较透彻地回答一个点上的问题,但是若将这个结果放到一个体系层面上,其功能又变得扑簌迷离,这是由“分析”主导的研究手段的局限所导致的,只有当这种“点”的结果积累得足够多的时候,体系的问题也会变得逐渐清晰起来,但这个过程一般需要长时间的积累。而蛋白质组是高度动态的,即使同一细胞在不同生理或病理环境中,其蛋白表达也是不同的,这种差异蛋白往往是某些疾病发生的标志。利用比较蛋白质组研究技术,可以批量观察正常与疾病细胞(组织)在蛋白质表达谱上的差异,从整体水平上规模化地筛选和发掘潜在的药物靶标,以及适用于早期诊断、介入和治疗的疾病蛋白标志物。但蛋白的功能仅仅从量的变化上分析往往会限制我们的研究视野,很多重要蛋白质的活性是由翻译后修饰调节的,有时蛋白水平上看不到明显变化但翻译后修饰水平已有显著变化。因此采用定量技术对内毒素刺激前后小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组学进行差异定量分析,对探讨由于内毒素刺激引起的线粒体损伤的分子机制,寻找一批与内毒素休克肝损伤的发生发展紧密相关的高特异性和高灵敏性的生物标记物是非常有价值的。荧光差异凝胶电泳(difference in gel electrophoresis,DIGE)是一种在2-D电泳之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上又引用了内标,内标的利用进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差实验结果的影响,从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。DIGE系统最大的优点就是整合了CyDye DIGE染料多重标记方法与DeCyder 2D差异分析软件的优势。本实验采用的统计分析软件为DeCyder 2D差异分析软件。该软件是由GE公司专门针对Ettan DIGE系统并利用CyDye DIGE Fluor荧光染料的多通道特性研发出来的。DeCyder 2D~(TM) 2D软件是一个自动化图象分析软件,它利用共找点检测的算法对Ettan DIGE系统荧光图像进行自动检测、背景消除、定量、归一化以及凝胶内和凝胶间匹配分析,从而避免了人为因素的影响,消除了不同操作者带来的系统误差。其中,本实验采用Decyder软件中DIA和BVA模块进行凝胶图像分析。不同凝胶内分析模式采用配对比较,以Cy2为内标计算比值,通过Cy3/Cy2及Cy5/Cy2的比率对应每个蛋白点含量,并对其进行标准化计算。重复2块胶用来计算每个蛋白点平均量的改变,并进行T检验,计算P值,设定P＜0.05为有显著性差异。基于上述思考,我们利用LPS来制作内毒素休克BALB/c小鼠模型,采用差速离心结合密度梯度离心提取和纯化了正常组和LPS刺激1 h后的小鼠肝细胞线粒体蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后,采用DIGE技术对两组磷酸化蛋白进行分离,建立了相应的差异蛋白图谱。通过DeCyder 2D差异分析软件分析后找到差异蛋白点105个,其中表达上调的有49个,表达下调的有56个。对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出42种蛋白质。数据库搜索发现有26种蛋白质为确证的磷酸化蛋白质,其中有24个磷酸化蛋白质的功能与线粒体密切相关。通过对鉴定的蛋白质作亚细胞定位预测分析,我们发现完全定位于线粒体内的有5个;既可定位于线粒体内,又可定位于其它多个亚细胞结构的有34个;在其它亚细胞结构定位,但是没有线粒体定位的有3个。通过定位预测分析后,我们又对蛋白质进行功能分析,并结合相关文献,我们把这些差异蛋白功能主要归纳为以下5类:参与蛋白质和脂质代谢;参与能量代谢;参与氧自由基生成调节;参与细胞凋亡;参与细胞信号转导。此外,采用String数据库和软件对所鉴定蛋白质的相互作用进行分析,发现其中27种蛋白具有直接或间接的相互作用,它们之间的关系可以用一张相互作用网络图来表示,这为我们进一步研究差异蛋白的功能指明了方向。通过研究,我们得出以下几点结论: 1.首先利用差速离心法结合密度梯度离心法提取小鼠肝细胞线粒体,并应用透射电子显微镜检测了所提取的线粒体的形态和纯度,结果表明该提取方法有效。 2.应用金属磷酸盐亲和层析树脂成功富集了线粒体磷酸化蛋白并利用2D-DIGE分离技术分离了正常和内毒素休克早期(LPS 1 h)BALB/c小鼠的肝细胞线粒体磷酸化蛋白,并建立了相应的差异蛋白图谱。通过相应的软件分析,得到了105个具有统计学意义的差异蛋白点。 3.对105个差异蛋白点进行质谱鉴定,去除角蛋白污染峰后,共鉴定出42种蛋白,其中发现有26种蛋白为已经确证的磷酸化蛋白质。 4.对42个差异蛋白进行亚细胞定位分析发现完全定位于线粒体内的有5个;既可定位于线粒体内,又可定位于其它多个亚细胞结构的有34个;在其它亚细胞结构定位,但是没有线粒体定位的有3个。 5.通过生物信息学分析把这些差异蛋白功能主要归纳为以下5类:参与蛋白质和脂质代谢;参与能量代谢;参与氧自由基生成调节;参与细胞凋亡;参与细胞信号转导。而且发现42种蛋白中有27种蛋白有直接或间接的联系,构成一张相互作用网络图。该研究方案能够成功的捕捉到内毒素休克早期小鼠肝脏线粒体差异磷酸化蛋白质组的变化,这为进一步加深我们对内毒素休克早期线粒体功能变化的分子机制的认识提供了理论基础,为深入研究脓毒症的发病机制及其防治策略提供了新的机遇。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R363

【参考文献】