miR-26b在人骨髓间充质干细胞体外软骨分化中的表达与功能

发布时间：2019-10-13 04:42

【摘要】： 背景肿瘤、创伤、炎症、代谢异常等造成的软骨损伤和退变是骨科临床上常见且尚不能有效解决的难题之一。组织工程技术的发展为软骨缺损的修复带来了希望,成为研究热点,作为种子细胞的骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能和自身强大增殖更新能力更被广泛研究。但软骨分化的诱导方法有待进一步的研究改进,分化调控及损伤修复的机制仍不是很清楚。microRNAs(miRNAs)是近年来新发现的一类长度约22个核苷酸的非编码RNAs分子。研究表明,它在干细胞的增殖、分化发育过程通过转录后基因调控发挥着重要作用,也有可能参与BMSCs体内外分化为软骨细胞的调控以及软骨发育、成熟及生物学特性的维持。本实验室前期研究中通过miRNAs基因芯片已获取BMSCs及其诱导分化的软骨细胞的差异性miRNAs表达谱。 目的本课题在人骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其诱导分化的软骨细胞中miRNA基因的差异表达谱的基础上进一步筛选和验证出软骨分化相关调控作用的miRNAs并研究其生物学功能,为进一步阐明miRNA在BMSCs软骨分化过程中的作用和意义提供实验基础。 方法(1)利用全骨髓贴壁培养法自人骨髓中分离BMSCs,在体外扩增传代培养,通过对其形态特点的观察、细胞表面标志物检测及多向诱导分化,对培养的人BMSCs进行鉴定。(2)采用体外单层培养方法,经含有TGF-β1、胰岛素、地塞米松、转铁蛋白、维生素C和牛血清白蛋白的软骨诱导培养液诱导21天,通过HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色对诱导分化的软骨细胞进行鉴定。(3)在人BMSCs及其诱导分化的软骨细胞miRNAs的差异表达谱的基础上,采用生物信息学分析及实时定量PCR进一步筛选和验证差异表达的miRNA基因。(4)转染miR-26b的模拟物及阻遏物至人BMSCs中,培养21天后,通过HE染色、甲苯胺蓝、免疫组织化学染色对转染后的实验组及对照组进行鉴定。 结果(1)经骨髓分离培养所得到的细胞符合骨髓间充质干细胞特征,流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD44为阳性,CD34、CD45为阴性,细胞周期仅有13.1%细胞处于活跃增殖期,体外经诱导可分化为成骨细胞及脂肪细胞。(2)人BMSCs经含TGF-β1、胰岛素、地塞米松、转铁蛋白、维生素C和牛血清白蛋白的G-DMEM培养基诱导21天后,HE染色、甲苯胺蓝、免疫组织化学染色均阳性,符合软骨细胞的特征。(3)筛选并验证了4个与软骨分化相关的miRNAs,miR-26b,miR-28,miR-130b,miR-152,这些miRNAs在软骨分化过程中表达增高。(4)转染miRNA-26b模拟物能促进人BMSCs向软骨细胞分化,转染miRNA-26b阻碍物后继续加入软骨诱导液培养时BMSCs仍可向软骨细胞分化。 结论综上所述,我们通过实验发现了:(1)用全骨髓贴壁生长法可以从骨髓中分离得到人BMSCs,并可在体外将其诱导分化为软骨细胞。(2)在人BMSCs及其软骨诱导分化过程中存在表达差异的miRNAs,这些差异性的miRNAs可能对人BMSCs的软骨诱导分化起着一定的调控作用,其作用受体内外多种环境因素的影响。(3)miRNA-26b在人BMSCs体外软骨分化中发挥促进的作用。
【图文】：

编码基因在不同物种的进化中具有高度的保守性，部分基因成簇，且常常协同表达，具有共同的调控功能。④ miRNAs作用靶点：多为转录或凋亡调控基因的完全或不完全配对的3’UTR的碱基对。1.2 miRNA的生成、作用机制和研究方法miRNA的生成经由细胞核和细胞质中两个过程完成[9]。在核内编码miRNA的基因在RNA pol-Ⅱ的作用下转录成长度数百个nt的前体转录本(pri-miRNA) ，随后被 Drosha 酶加工形成约 60nt 的发夹结构的茎环前体( pre-miRNA)。它与双链RNA结合蛋白形成微处理体并随后由Ran-GTP及其受体Exportin-5转运出核，并由胞浆中的Dicer酶加工成约22nt的双螺旋链miRNA分子，其中成熟的miRNA被选择性地装配进特异RNA诱导沉默复合体（RISC）中发挥作用，互补链立即被降解。(见图1)

编码基因在不同物种的进化中具有高度的保守性，部分基因成簇，且常常协同表达，，具有共同的调控功能。④ miRNAs作用靶点：多为转录或凋亡调控基因的完全或不完全配对的3’UTR的碱基对。1.2 miRNA的生成、作用机制和研究方法miRNA的生成经由细胞核和细胞质中两个过程完成[9]。在核内编码miRNA的基因在RNA pol-Ⅱ的作用下转录成长度数百个nt的前体转录本(pri-miRNA) ，随后被 Drosha 酶加工形成约 60nt 的发夹结构的茎环前体( pre-miRNA)。它与双链RNA结合蛋白形成微处理体并随后由Ran-GTP及其受体Exportin-5转运出核，并由胞浆中的Dicer酶加工成约22nt的双螺旋链miRNA分子，其中成熟的miRNA被选择性地装配进特异RNA诱导沉默复合体（RISC）中发挥作用，互补链立即被降解。(见图1)
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

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本文编号：2548486