抗异柠檬酸脱氢酶单链抗体及单克隆抗体的制备

发布时间：2019-10-18 12:17

【摘要】： 诸多研究结果表明:肝癌的发生和发展与线粒体有着密切的联系,而黄曲霉毒素B1(AFB1)又是诱导肝癌发生的最主要外界因素之一。AFB1不仅能使小鼠逐渐消瘦,引发肝脏组织癌变,还能诱导或是抑制肝脏部分蛋白的表达,idh3α蛋白是其差异蛋白之一。本研究制备的抗体可用于Western-blotting验证不同环境下哺乳动物细胞内IDH的表达水平,并通过亲和层析和免疫共沉淀等方法鉴定IDH的互作蛋白。本研究首先将idh3α构建到pET-32a上,并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌中。通过IPTG诱导阳性菌,成功表达了IDH3α融合蛋白。并过Ni柱得到纯化的蛋白,纯化的蛋白用于免疫BALB/C实验小鼠,达到一定的效价后分别分离小鼠脾脏细胞制备单克隆抗体和提取脾脏RNA制备基因工程单链抗体。将免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,形成杂交瘤细胞,HAT培养液培养筛选,ELISA检测,阳性杂交瘤细胞克隆化3次,检测,筛选出一株能稳定分泌高亲和力、高特异性的单克隆抗体的细胞株,最后将抗体纯化和性质鉴定。从免疫后小鼠的RNA中,反转录并扩增单链抗体轻重连可变区基因片段,经灵活短肽连接,组装成单链抗体基因,再将此基因构建到噬菌体载体上,建立噬菌体单链抗体库,富集淘选,筛选出一株稳定的高亲和力、高特异性的重组子,然后进行可溶性表达,纯化,鉴定,即可制备出单链抗体。
【图文】：

黄曲霉毒素B1,化学结构,黄曲霉毒素

101.2 黄曲霉毒素的化学结构及理化性质图1-1所示的是几种常见的黄曲霉毒素的化学结构。黄曲霉毒素是结构相似的一组化合物，均为二呋喃香豆素(difuranocoumarin)的衍生物。目前已经分离鉴定的黄曲霉毒素有20余种，饲料中污染的黄曲霉毒素只有B1、 B2、 G1和G24种。AFB1和AFB2在紫外线照射下发蓝色荧光，AFG1和AFG2在紫外线照射下发黄绿色荧光[1]；黄曲霉毒素耐热，在一般的烹调加工温度下很少被破坏，加热到280℃才裂解破坏；黄曲霉毒素不溶于水，在酸性条件下也较稳定，但在碱性条件下(pH>9)黄曲霉毒素的内酯环形成香豆素钠盐，可迅速分解，此反应可逆；黄曲霉毒素可溶解于油和一些有机溶剂中，如氯仿、甲醇等，但不溶于正己烷、石油醚和乙醚。1.3 黄曲霉毒素的毒理学AFB1本身并不是致癌物质

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术能构建容量大、特异性强的完全人源性抗体，在 HIV 等病毒感染和肿瘤方面有独特的优越性和远大的应用前景[38,39]。噬菌体抗体库技术的原理简言之，就是用 PCR 技术从免疫细胞中扩增体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，通过一段编码连接肽基拼接后组装成单链抗体基因（scFv），然后将其克隆到噬菌体载体上，使抗噬菌体的衣壳蛋白在噬菌体表面融合表达，然后利用抗原－抗体特异性结合出表达特异性抗体的噬菌体[40,41]，，并进一步感染和扩增。如果建库过程中和 VL随机组合，便可建成组合抗体文库。构建噬菌体抗体库主要有以下几个步骤：①抗原纯化，免疫动物；②提疫动物脾细胞 RNA 并反转录为 cDNA；③扩增 VH、VL，组装 scFv；④噬表面抗体库的构建与淘选；⑤scFv 的可溶性表达与 ELISA 检测。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】