东方田鼠抗日本血吸虫相关靶基因的筛

发布时间：2019-10-28 08:23

【摘要】： 血吸虫病是世界性分布的、危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一。东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。探索东方田鼠抗日本血吸虫机理,筛选东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因或靶基因,对研制抗日本血吸虫疫苗和治疗药物具有重要借鉴意义。本研究首先比较东方田鼠组织器官/裂解物及血清、灭活血清对体外培养日本血吸虫童虫的杀伤效果,然后选用杀伤力较高的肝脏和肺脏裂解物分别亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫(Sj44d)噬菌体展示cDNA文库,对获得的部分阳性克隆进行序列测定、生物信息学分析、免疫保护效果评估、全长序列的克隆和表达。 1、将东方田鼠肝脏裂解物、肺脏裂解物、脾脏裂解物、肌肉裂解物、血清和灭活血清分别与日本血吸虫机械断尾童虫在体外共培养,在培22h,童虫死亡率分别为33.51%、36.33%、3.92%、16.31%、27.06%和29.32%;在培养48h,童虫死亡率分别为83.07%、69.25%、28.34%、35.91%、86.14%和83.14%。研究结果显示,除已有报道东方田鼠血清对体外培养血吸虫具有较高的杀伤作用外,本研究发现肺脏、肝脏作为血吸虫移行、发育的承载器官,其组织裂解物对血吸虫也表现显著的杀伤作用引人注目,对深入探究东方田鼠抗日本血吸虫机理有重要意义。 2、用肝脏裂解物和肺脏裂解物分别筛选日本血吸虫成虫(Sj44d)噬菌体展示cDNA文库,经过三轮筛选后,随机挑取168个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析,获得了32条有效展示的EST序列,其中22条EST序列与已知血吸虫基因或表达序列标签同源,1条EST序列与其他物种基因同源,为新的血吸虫表达序列标签,9条EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。对23条具有同源序列知识背景的EST序列的功能分析结果显示,上述EST及其编码蛋白的功能主要与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示,东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,使其发育畸形和延迟,为深入揭示东方田鼠天然抗血吸虫特性的分子机理提供重要基础。 3、将肝脏裂解物筛选获得的除卵壳蛋白外的所有阳性噬菌体克隆进行组合后分别免疫BalB/c鼠,最高获得了32.90%的减虫率,33.33%的减雌率,95.49%的粪便减卵率,87.41%的肝脏减卵率。ELISA检测结果显示,各免疫组均产生了较高的抗血吸虫成虫可溶性抗原的特异性抗体。结果表明,本研究筛选获得的大多EST序列可为挖掘抗日本血吸虫疫苗候选抗原或药物靶标提供重要资源。 4、根据筛选获得的EST序列和生物信息学分析结果,以PCR和SMART RACE技术克隆其中部分基因的全长ORF序列,共克隆了2条可能的东方田鼠抗性相关靶基因的全长ORF序列,其基因功能分别与磷酸二酯酶活性和核糖体结构组成相关。成功构建了一个全长ORF序列的重组表达质粒并在大肠杆菌中成功表达,表达产物的分子量分别为19.4kD,具有重要的学术价值和应用潜力。本论文研究发现东方田鼠肝脏、肺脏裂解物具有显著杀伤作用,首次应用东方田鼠肝脏和肺脏裂解物筛选东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因,获得一批具有深入研究价值的靶分子、EST序列及全长cDNA,对探索东方田鼠抗日本血吸虫的分子机理、开拓抗血吸虫疫苗和药物研究新途径具有重要意义。
【图文】：

噬菌体展示,东方田鼠,肝脏,PCR鉴定

硕士学位论文第三章日本血吸虫抗性相关靶基图 1 东方田鼠肝脏提裂解物筛选 Sj44d 噬菌体展示 cDNA 文库第一轮 PCR 鉴定结果 The first turn PCR rssult of screening Sj44d phage display cDNA library by liver extraction o1-16 随机挑取的噬菌体克隆 PCR 产物1-16 PCR product of the randomly picked phage clones

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噬菌体富集了近百倍，PCR 鉴定（图 1、2）显示，随着筛选 2 东方田鼠肝脏裂解物筛选 Sj44d 噬菌体展示 cDNA 文库第三轮 PCR 鉴定结ird turn PCR result of screening Sj44d phage display cDNA libray by liver extraction1-14 随机挑取的噬菌体克隆 PCR 产物1-14 PCR product of the randomly picked phage clones图 1 东方田鼠肝脏提裂解物筛选 Sj44d 噬菌体展示 cDNA 文库第一轮 PCR 鉴he first turn PCR rssult of screening Sj44d phage display cDNA library by liver extra1-16 随机挑取的噬菌体克隆 PCR 产物1-16 PCR product of the randomly picked phage clones
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

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