赭曲霉毒素A人工抗原构建及其多克隆抗体的制备

发布时间：2019-10-28 09:24

【摘要】： 赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OA)是一种有毒性的真菌次级代谢产物,主要由某些曲霉和青霉产生,可污染粮食、蔬菜及咖啡、葡萄、可可等经济作物,由于可污染物种很多,且产毒菌株可适应的环境广泛,因此已造成了全球的广泛传播。它具有较强的肾毒性和肝毒性,并具有致畸性、致癌性、免疫毒性和胚胎毒性,很多国家都设立了限量标准,因此建立成本低且快速有效的现场检测方法极为重要。免疫学方法由于其快速、高灵敏度、高特异性、成本低以及携带操作方便等优点已得到广泛的青睐。 本实验采用活性酯法将OA与载体蛋白偶联制得人工抗原,经过紫外、红外、荧光光谱以及圆二色谱对其进行了比较全面的鉴定分析,并通过荧光猝灭进一步探讨了OA与载体蛋白的反应机制,随后免疫BALB/c小鼠,研究了抗血清的各项特性,并进行了加标回收和实际样品检测,建立了间接竞争ELISA。 1赭曲霉毒素A人工抗原的构建 OA是小分子物质,分子量仅为403.8,因此属于只有反应原性而无免疫原性的半抗原,只有通过与载体蛋白偶联构建成人工抗原后才能有效地刺激机体产生抗体。本研究利用OA结构中的羧基,采用活性酯法将OA与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)偶联,制备免疫抗原OA-BSA和包被抗原OA-OVA。 通过紫外、红外、荧光光谱以及圆二色谱法对人工抗原进行分析,在紫外光谱中,载体蛋白与OA的结合导致OA酚羟基pKa降低,以致吸收峰红移至380nm处,OA与BSA和OVA的偶联摩尔比分别达到11：1和7.6：1,OA的利用率分别为50.5%和38.6%。；在红外光谱中,较载体蛋白而言,人工抗原在1545cm-1处的伯胺基吸收峰明显降低,且OA内酯环在载体蛋白的作用下于1589cm-1处出现一个小而尖锐的峰；在荧光光谱中,OA对人工抗原中载体蛋白在340nm处的特征峰产生强烈的猝灭作用,并通过同步荧光进一步分析,OA对酪氨酸残基和色氨酸残基皆有猝灭作用,且人工抗原中两种残基的荧光峰位都有小幅度的蓝移,说明偶联后其极性降低,疏水性增强。以上结果均表明,OA与载体蛋白成功的通过活性酯法发生了偶联。另外,通过不同浓度OA与BSA的混合液的荧光光谱分析,对OA与BSA的偶联反应进行进一步探讨,我们发现随着OA浓度的提高,OA对BSA的猝灭作用逐渐加强,但趋势渐缓,且远远不能达到活性酯法制备的免疫原OA-BSA的猝灭程度,而在同步荧光中也证明,混合液中OA只对亮氨酸残基产生了荧光猝灭,这都证明了活性酯法的有效性。人工抗原的圆二色谱中,正峰和负峰强度都明显降低,经过CDSSTR软件分析得知蛋白的α-螺旋含量降低,而β-折叠含量升高,说明其结构更为伸展,更有利于OA暴露于蛋白表面；而混合液中,随着OA浓度的增大,负峰强度逐渐增强,经过CDSSTR软件分析得知,蛋白的α-螺旋含量升高,而β-折叠含量降低,这意味着肽链收缩,蛋白的疏水性增强。人工抗原的荧光光谱和圆二色谱与混合液的显著差别,充分证明人工抗原制备成功。 2抗OA抗血清的制备及其性质研究 以OA-BSA免疫三组BALB/c小鼠,每组三只,免疫抗原剂量皆设定为80μgOA-BSA/次／只,第一组免疫周期为21d,第二组免疫周期为14d,第三组免疫周期为7d。通过抗体生成曲线我们看出,三组小鼠均对OA-BSA产生了免疫应答,第一组和第二组在第三次免疫后抗体产生显著,第四次免疫后抗体产生开始趋于平缓,而第三组在第六次免疫后抗体才明显产生,而第七次免疫后抗体产生开始趋于稳定。对第一组小鼠第三次免疫后、第二组小鼠第四次免疫后以及第三组小鼠第七次免疫后的抗血清进行性质分析,其效价均在105左右。通过方阵实验测得其抗原抗体最佳反应浓度后,采用间接竞争ELISA的方法测定三组小鼠抗血清的灵敏度,发现第一组小鼠确定为第一组小鼠灵敏度在5-7ng/mL,线性范围在1-10ng/mL,第二组小鼠灵敏度在13-15ng/mL,线性范围在1-100ng/mL,第三组小鼠灵敏度在28-37ng/mL,线性范围在1-100 ng/mL。对小鼠抗血清进行特异性分析,结果显示该抗血清特异性较好,与参试的黄曲霉毒素B1、桔霉素、玉米赤霉烯酮均无交叉反应。 3赭曲霉毒素A的加标回收和实际样品检测 通过icELISA制得了OA抗血清检测OA的ELISA标准曲线,其线性方程为y=-0.1397x+1.9539,R2=0.9937。经ELISA分析,确定OA的平均添加回收率为71.5%-88.2%,变异系数为0.137%-20.56%。在此基础上,将从华中农业大学附近市场购买的若干大米和玉米样品和湖北省农业科学院惠赠的样品进行实际样品检测,部分样品中有可检出OA。
【图文】：

OA一BSA1.抚rm司五.t亡2(un胜.bl晚)图2一 1oA一BsA的合成途径示意图FigZ一 1ThesehematieillustrationofOA一 BSAsynthes九 ePathway3.2紫外一可见光谱分析OA、BSA、O、叭以及人工抗原OA一BSA、OA一O、叭进行UV一Vis吸收光谱分析，结果如图2一2、2一3所示。1，5‘一，卜一-问.一一刁卜-330日S八《，mglmL)OA《0.135nlglmL)OA.BSA(lmglmL)00匕月q‘O的q哎0.0一25040。…图2一 2BSA、oA和oA一BsA的uv-vis光吸收图谱Fig.2一 2UV-VissPeetrogramofBSA， OAandOA一BSA

0.0十250图2一 3OvA、oA和oA一ovA的uv-vis光吸收图谱FigZ一 3UV-VissPeetrogramofOVA， OAandOA一0、/A由图2一2和图2一3可知，偶联反应之前OA的最大紫外吸收峰在 330nm处，BSA与ovA最大紫外吸收峰在278nln处，而人工抗原OA一BSA与OA一ovA在380nln处有最大紫外吸收峰，这是由于OA在与载体蛋白结合后，在载体蛋白的作用下，其酚轻基pKa大大降低，以致吸收峰发生了红移 (Chuetal.
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【引证文献】

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1 王莹;同时检测多种真菌毒素的生物芯片技术研究[D];华中农业大学;2012年

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本文编号：2553045