霍乱弧菌ToxR调控单元中毒力基因的调控机制研究

发布时间：2019-10-29 04:13

【摘要】： 霍乱弧菌是霍乱的病原体,其两个主要的毒力决定子是霍乱毒素CT和毒素共调菌毛TCP,CT能够引起霍乱样的腹泻,TCP则是霍乱弧菌能够黏附并定植在小肠上皮的必要条件。大量的研究表明,复杂的调控级联调节着霍乱弧菌这些毒力基因的表达。其中,霍乱弧菌毒力基因ctxAB和tcpA均受到霍乱弧菌主要的直接转录激活子ToxT的调控,ToxT属于AraC/Xyls家族。除此之外,ToxT还能抑制msh操纵子的转录。而ToxT的表达又受ToxR和另外一个转录激活子TcpP的共同调控。并且,ToxR还可激活外膜蛋白基因ompU、抑制外膜蛋白基因ompT的转录。本课题中,我们研究了霍乱弧菌关键毒力调控子ToxR在不同条件下的表达水平,并发现在生长平台期,与野生株相比,aphB缺失株中toxR的表达降低。AphB之前已经被证明能够和AphA相互作用共同激活tcpP,本研究中电泳迁移率变动分析表明AphB能够直接结合在toxR的启动子区,并进而激活toxR的启动子。而且,AphB能够通过对toxR表达的影响进而调节toxT的表达。我们还分析了AphB对ToxR调控的外膜蛋白OmpT和OmpU的作用。这些结果显示,霍乱弧菌存在着另外一条调控回路,即AphB激活两个毒力调控子ToxR和TcpP,ToxR和TcpP一起调节主要毒力调控子ToxT的表达。 ToxT在致病过程中发挥关键性的作用,可以调控两种四型菌毛：甘露糖敏感血凝素MSHA和毒素共调菌毛TCP。MSHA作为一种抗定植因子,它的表达不利于霍乱弧菌在宿主内生存定居。之前的研究认为,ToxT需要二聚体的形成才可以发挥其调控转录的作用。我们的实验发现并证明了ToxT可以通过结合在msh操纵子的启动子区,进而直接抑制msh操纵子的转录,并且不需要形成二聚体这一转录抑制即可发生,提示,ToxT使用了不同的机制来调节霍乱弧菌所有组成部分的转录。 霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌,并广泛存在于水生环境中。生存环境的恶劣,可以导致霍乱弧菌进入一种特殊的状态——活的非可培养(Viable but nonculturable, VBNC)状态,使用常规的实验室检测技术不能检出这种特殊状态的霍乱弧菌,但其仍具有致病性,动物实验也发现经肠道复苏可致病。在本研究中,我们在实验室环境中成功诱导了霍乱弧菌进入VBNC状态。在这一过程中,我们使用平板菌落计数描述了可培养细菌数的趋势,以及通过使用LIVE/DEAD荧光染色方法,观察了活菌百分比的变化。而且,我们比较了在低温低营养条件下培养了4小时和24小时的细胞与在丰富培养基中处于对数生长期的细胞的整体转录水平,并描述了在这两个时间点的基因表达情况。我们发现超过300个基因均发生了改变,同时我们选取了一对toxin-antitoxin基因(VCA0391/2)进行研究,观察其是否能够帮助霍乱弧菌在恶劣条件下逃避死亡
【图文】：

霍乱是一种严重的脱水性腹泻疾病，每年能够影响到数以万计的人。这种重的肠道疾病最显著的特点是大量的水样便的出现，人体这种突然的大量失水导致严重的脱水、低血容量性休克、酸中毒，如未即时医治，有可能会导致器衰竭甚至死亡[I]。自从1817年以来，七次霍乱的大流行己经波及全球[2]，到目为止，我们依然处在第七次大流行当中[3]。霍乱弧菌则是导致霍乱疾病发生的原菌，它是一种革兰氏阴性菌，一般存在于水体中。霍乱弧菌在进入人体经过酸消耗后，剩余的细菌则能够进入小肠并定植在小肠的上皮细胞。四型菌毛T的表达在霍乱弧菌定植小肠的过程中是必需的[4-6]。一旦霍乱弧菌成功定植在肠，将产生霍乱毒素CT，从而导致严重的腹泻的产生。CT和TCP是霍乱弧的两个主要的毒力因子，cT是由。翩B编码的，位于溶源性噬菌体CTx小上TCP由才以“编码调控。它们均受到一个调控网络的控制，即ToxR调控单元(如图l一l所示)。

和酶切鉴定，将构建成功的质粒pviKnZ衣次尺电转进入sM10感受态细胞，并与霍乱弧菌lacZ一缺失株的进行接合，卡那霉素抗性平板进行筛选得到目的菌株r以尺一lacZ。(如图1一4所示)图1一4.pvIKllZ一才仍火质粒图谱及同源重组示意图A.构建的质粒pVIKllZ寸山成，才山火启动子在lacz上游。B.同源重组示意图，，才山火启动子位于报告基因lacZ上游，同时下游还有一完整的才山火基因。2.4在体外不同条件下，检测勿工丑表达水平。ToxRS蛋白和TcpPH蛋白共同作用，可以激活霍乱弧菌毒力关键因子ToxT的表达。并且有研究发现汀印尸仔的表达受到AP叭和APhB的诱导l‘4，’4]，而toxR则被认为是组成性表达的
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 刘端;细菌“活的非可培养状态”研究进展[J];疾病监测;1998年09期

2 徐怀恕,R.R.Colwell;霍乱弧菌的越冬方式—活的非可培养状态及其检测方法[J];青岛海洋大学学报;1989年02期

3 许兵，徐怀恕，纪伟尚;活的非可培养状态霍乱弧菌的复苏[J];青岛海洋大学学报;1994年02期

4 徐怀恕,黄备,祁自忠,王祥红,纪伟尚;霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的细胞形态研究囿——活的非可培养状态细胞[J];青岛海洋大学学报;1997年02期

本文编号：2553376