大鼠EPCs的标记方法及TBI大鼠外周血中的EPCs的变化趋势

发布时间：2019-11-02 15:43

【摘要】： 目的:本研究组前期临床观测发现颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)患者外周血中内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量存在着先降低后上升的变化特征,为了进一步研究外周血中EPCs变化机理,须建立相关的动物研究平台。本研究目的:1.建立一种大鼠外周血中EPCs的分离、标记方法,使用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)双抗体标记技术检测大鼠外周血中EPCs的数量;2.利用大鼠液压颅脑创伤(Fluid-Percussion injury,FPI)模型,探明TBI后大鼠外周血中EPCs的变化趋势;3.探讨TBI后EPCs与白细胞、血小板的相关变化趋势,为研究TBI后外周血中EPCs的变化机理提供参考。 方法:1.使用健康成年雄性WISTER大鼠共45只(体重300-350g,鼠龄12周),分为假手术对照组(n=10)及TBI组(n=35)。假手术对照组大鼠仅给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。TBI组使用液压打击仪及小动物立体定向仪,分别建立轻、中、重型大鼠闭合性颅脑液压损伤模型,轻型组(n=10)液压打击力度为1atm,中型组(n=10)液压打击力度为2atm,重型组(n=15)液压打击力度为3atm;2.TBI后24h,按照随机原则从各TBI组中各抽取2只大鼠分别进行头颅MR检查和脑组织切片HE染色,观察TBI的影像和病理特征。其余大鼠分别于伤前24h和伤后不同时间点(3h、6h、24h、48h、72h、240h、336h)使用硬质玻璃毛细采血管(φ=1mm)取大鼠内眦球后静脉丛血液约1.1ml,进行外周血EPCs测定,同时使用小动物外周血细胞检测设备进行白细胞和血小板测定;3.采用Ficoll密度梯度离心法分离大鼠外周血单个核细胞,以CD34、CD133双抗体阳性作为EPCs标志,使用CD34、CD133双抗体标记结合流式细胞计数方法,检测大鼠外周血中EPCs的数量。 结果:对照组10只大鼠完成了各时间点大鼠外周血循环中相应指标测定;轻型TBI组中1只大鼠因打击后3天头部切口感染被剔除,其余7只大鼠完成了各时间点大鼠外周血循环中相应指标测定;中型TBI组中1只大鼠于打击后48h死亡,其余7只大鼠完成了各时间点大鼠外周血循环中相应指标测定;重型TBI组中2只于打击后24h死亡,4只于打击后48h死亡,其中1只因眼内眦取血处严重感染被剔除,其余7只大鼠完成了各时间点大鼠外周血循环中相应指标测定;实验中途死亡大鼠(n=6)的相应数据作为死亡组进行分析。 1.大鼠外周血循环中存在表达CD34、CD133双阳性的EPCs,本研究测定显示:正常大鼠外周血循环中EPCs为33-61个/20万单个核细胞,平均为47个/20万单个核细胞; 2.TBI后大鼠外周血中EPCs数量在伤后下降至正常水平以下,于伤后3h达最低点,至10-30个/20万单个核细胞,各组间下降幅度无显著差异; 3.TBI后大鼠外周血中EPCs数量在伤后3-6h渐升高至正常水平以上,于伤后6h达最高点,轻型组平均升至80个/20万单个核细胞,中型组平均升至68个/20万单个核细胞,重型组平均升至51个/20万单个核细胞,此后EPCs逐渐下降,伤后24h各组EPCs均降至正常水平;TBI后死亡的大鼠外周血中EPCs在伤后3h也下降至最低点,在伤后3-6h虽有上升趋势,但达不到正常水平,死亡前外周血中EPCs呈持续下降趋势; 4.TBI后大鼠外周血中EPCs数量变化与血小板、白细胞数量均无显著相关。 结论: 1.采用CD34、CD133双抗体标记技术结合使用流式细胞仪检测、可以良好地定量测定大鼠外周血中的EPCs; 2.本实验显示:与TBI患者伤后外周血中EPCs的变化特征相似,TBI后存活的大鼠外周血的EPCs水平同样存在先降低,后增高,再逐渐降至正常的变化特征; 3.外伤越严重,外周血中的EPCs增高幅度越小,而伤后死亡大鼠外周血中EPCs的水平持续于正常水平以下,提示:TBI后外周血中EPCs的水平持续低下是预后不良的指征。 4.本实验显示:TBI大鼠伤后外周血中的EPCs的数量变化与血小板和白细胞数量均无显著相关。
【图文】：

图5.TKRZo0C型小动物呼吸机(3)将混匀后的2ml抗凝血液标本与离液中(HISTOPAQ咙1083一l)，在20(4)离心后标本分层明显，用取样枪于离心管，加入ZmlpBS缓冲液，在20洗涤;(5)弃上清，加入lmlPBs缓冲液，

天津医科大学硕士学位论文图1.打击部位图2.液压冲击颅脑创伤仪与大鼠头部连接图3.MODEL01一B型液压颅脑创伤仪图4.与液压打击仪相连接的示波器图5.TKRZo0C型小动物呼吸机(3)将混匀后的2ml抗凝血液标本与PBS缓冲液缓慢加入3ml淋巴细胞分离液中(HISTOPAQ咙1083一l)，在20oC以2400印m离心20min;(4)离心后标本分层明显，用取样枪吸取中间白膜层(单个核细胞层)，置于离心管，加入ZmlpBS缓冲液，在20oC以2400印m离心10min，进行第一次洗涤;(5)弃上清，加入lmlPBs缓冲液
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329.25

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