马耳他布氏菌弱毒疫苗M5-90外膜蛋白BP26和OMP31抗原表位及其疫苗免疫评价

发布时间：2019-11-06 00:15

【摘要】：背景：布鲁氏菌在我国为乙类病原微生物,主要引起布鲁氏菌病,简称布病,是目前世界上流行最广、危害最大的人兽共患病之一。布病可引起动物的流产和不孕,引起人急性波状热等,容易转入慢性引起肝脾、淋巴结肿大,关节炎等变态反应性疾病。有部分病例表明布病可导致孕妇流产,甚至还出现母婴垂直传播。据统计资料表明,全世界每年约有50万人感染布鲁氏菌病,每年因该病造成的经济损失近30亿美元,而中国处于人间布病发病率超过1/10万的国家之一,为布病“重灾区”国家,主要威胁宁夏、新疆、浙江、山西、甘肃、辽宁、上海、青海、河北、江苏等约28省。据中国CDC报告,2005～2008年全国布病新发病人分别为18416、19013、21901、30002例,2006年、2007年发病数上升到全国甲类、乙类传染病发病数顺位的第10位。2009年(37734例)发病人数超过3.5万,达历史新高。但2012年最新CDC的统计报告显示发病人数已接近4万,至39875人,以平均每年10%的速率上升,赫然成为最严重的公共卫生问题之一。在人感染布菌中,80%以上是通过接触感染羊及其产品导致的。因此,预防人的布病首要是预防羊布菌感染。布鲁氏菌是一种能引起变态反应的兼性胞内寄生菌,主要寄生在一些专职和非专职吞噬细胞中,如巨噬细胞和上皮细胞等。据不完全统计,世界上有近60种野生动物对布鲁氏菌侵袭可产生各种血清学反应,近30种野生动物身上寄生了各生物种的布鲁氏菌。在我国流行的主要为羊、牛、和猪种,羊种(B.melitensis)占流行株80%,牛种(B. abortus)占10%,猪种(B. suis)不到1%。B. melitensis是绵羊和山羊的致病菌,也是对人毒力最强、危害最大的亚种。布鲁氏菌病临床症状复杂,引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆；医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布氏菌感染,给诊断带来了一定的困难,容易导致误诊,造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段,抗生素的大量长期使用仍很难见效,且容易引起耐药性问题。因此,布鲁氏菌的疫苗预防和早期快速诊断对布菌的防控具有重大的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊断的准确性就显得尤为重要。预防布病的疫苗,必须能有效诱导以产生IFN-γ为特征的Thl型细胞免疫反应,尤其是CTL介导的细胞毒效应。羊种布菌疫苗M5-90是我国自主研发用于绵羊和山羊接种的减毒活疫苗,免疫效果相对较好。但是缺乏其在天然宿主羊免接种后,体液和细胞免疫反应水平及免疫保护效果的相关研究,并且M5-90疫苗株也存在两个缺陷：一是免疫动物与自然感染动物不能区别,严重影响了布病的诊断和检疫；二是疫苗毒力较强,可引起部分孕畜流产。因此,研制一种新型的毒力低、免疫效果好、能进行鉴别诊断的分子标记疫苗势在必行。目前,国内外倾向于采用基因工程的手段对布菌现有疫苗进行改造。国外曾有研究报道了羊种布菌疫苗株Rev.1BP26基因缺失株(CGV26)并发现其仍具有免疫保护效果。但是,国内研究人员对M5-90菌株进行改造,敲除BP26得到新的突变株M5Δbp26,其毒力有所下降,但免疫应答弱于原疫苗株,持续时间短,免疫效果达不到要求；相似的情况还出现在Rev.1的omp31缺失株中。由此推断,BP26和OMP31蛋白可能与疫苗株毒力和保护性抗原相关,若将M5-90疫苗株携带的BP26基因全部敲除,则影响弱毒疫苗株的免疫效果。 BP26蛋白布菌的一种外膜间质蛋白,在布菌多数亚种中具有高度的保守性。在感染的牛,绵羊,山羊和人中是一种免疫显性优势抗原,可作为动物和人布病的诊断抗原,准确率可达到86%以上。OMP31为膜孔蛋白,其基因序列在不同的种属之间的同源性高达98%以上,在牛种菌中缺失,在羊种和猪种之间存在大约9个核苷酸的差异,并存在氨基酸序列的改变,故OMP31的单克隆抗体可能能够鉴别诊断不同生物型的布鲁氏菌感染。因此,我们设想在保留M5-90中BP26和OMP31蛋白的保护性抗原表位前提下,针对这两蛋白抗原表位及毒力相关位点进行分子修饰或改造,构建分子标记的弱毒疫苗株,提高布鲁氏菌疫苗免疫保护效果,并建立表位Peptide-ELISA诊断方法解决免疫与野生菌株感染的鉴别诊断技术难题。目的：本研究旨在测定布菌M5-90疫苗弱毒株在免疫羊后的体液和细胞免疫保护应答,揭示布菌M5-90弱菌毒株优势蛋白BP26和OMP31蛋白T和B细胞抗原表位,评估其与免疫保护效果相关性,最终绘制出M5-90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性图谱,给弱毒疫苗株的基因工程改造提供实验数据支持。方法：实验采用试管凝集和虎红平板凝集实验和ELISA检测M5-90疫苗菌免疫前0个月和免疫后0.5,1,2,2.5,7.5个月抗体的变化,以检测免疫后体液免疫效果。采用IFN-γ的酶联免疫斑点印迹检测技术(ELISpot),使用BP26和OMP31的重叠多肽刺激免疫前和免疫后0.5,1,2,2.5,7.5个月的羊PBMCs,检测分泌IFN-γ的T细胞数量变化,以反映疫苗免疫后机体的细胞免疫保护应答效果。根据免疫后进行的IFN-γ酶联免疫斑点印迹检测结果,筛选能特异性刺激T淋巴细胞产生IFN-γ,的多肽,即BP26或OMP31蛋白的T细胞表位。采用原核表达技术,制备M5-90菌株重组OMP31(rOMP31)蛋白。以rOMP31蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾细胞与骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备OMP31单克隆抗体。以M5-90菌株提取的含天然OMP31的膜蛋白(NMP)和菌体破碎上清为抗原,采用Western Blot和ELISA方法测定制备的单克隆抗体的特性；以合成的OMP31重叠多肽,采用Peptide-ELISA方法筛查和鉴定单克隆抗体识别的抗原表位。结果： 1)疫苗免疫效果测定：实验测定了M5-90疫苗株免疫后的美利奴羊和哈萨克羊的体液和细胞免疫应答水平。发现M5-90疫苗可以诱导产生特异性抗体,在疫苗接种后0.5个月的凝集(SAT)抗体达到高峰,随之快速下降并对加强免疫无明显反应；相反,针对外面蛋白的ELISA抗体长时间保持较高水平。细胞免疫应答方面,M5-90疫苗接种能够诱导T细胞免疫分泌特异性INF-γ,部分强势表位反应性强,但总体水平低,持续时间短,可能与Treg细胞快速活化和增殖相关。 2)BP26和OMP31蛋白T细胞表位筛查：利用重叠多肽的ELISpot实验对BP26和OMP31的抗原T细胞表位进行测定,筛选出19个反应多肽(BP2610条,OMP319条),其中含10个高频率共同性或优势表位多肽,分别为BP26-06:42VTGEGMMTASPDMAIL57, P26-08:60SVLRQAKTAREAMTAN75, P26-11:87KKAGIEDRDLQTGGIN102, P26-12:96LQTGGINIQPIYVYPD111和OM P31-09:69EQVSGSLDVTAGGFVG84, OMP31-14:114SISAGASGLEGKAETK129, OMP31-17:141GYTATERLMVYGTGGL156, OMP31-18:150VYGTGGLAYGK VKSAF165, OMP31-23:195INNNWTLKSEYLYTDL210, OMP31-26:222FLESKV NFHTVRVGLN237。这些多肽可以诱导两种不同品系免疫羊的T细胞反应。筛选出5个品系特异性表位多肽,包括BP26-10:78AMTKVLDAMKKAG IED93, BP26-18:150LGVNQGGDLNLVNDNP174, BP26-21:177VANAIAKAKTL ADAAG192, BP26-22:186TLADAAGVGLGRVVEI201和OMP31-12:96NGVVLG AETDFQGSSV111。这些表位多肽诱导单一品系免疫羊产生特异性INF-y分泌。筛选出4个低频率的个体差异性表位多肽包括：BP26-15:123GYSVSTSLTVRVRELA138, BP26-23:195LGRVVEISELSRPPMP210, OMP31-06:42GGYIGIN AGYAGGKFK57, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192。这两个表位多肽诱导个别免疫羊产生T细胞应答反应。为了分析T细胞表位多肽与宿主遗传免疫限制的相关性,实验对11只免疫羊进行了MHC I等位基因全序列和MHC II DRB1exon2等位基因序列的多态性分析。 3) OMP31蛋白B细胞表位筛查：以重组OMP31蛋白,制备了22株能够识别羊布氏菌M5-90弱毒疫苗天然oMP31抗原的单克隆抗体,包括了11株IgG2a、5株IgGl和6株IgM三种亚型,识别线性,半构象和构象三种B细胞抗原表位。新发现了5个B细胞线性表位,分别为OMP31-05:33APVDTFSWT GGYIGIN48, OMP31-11:87QAGYNWQLDNGVVLGA102, OMP31-20:168GDDA SALHTWSDKTKA183, OMP31-21:177WSDKTKAGWTLGAGAE192, OMP31-24:204EYLYTDLGKRNLVDVD219.其中OMP31-21同为T细胞表位。 4)BP26与OMP31抗原T和B细胞表位简图：根据BP26与OMP31抗原对M5-90免疫羊T细胞或重组蛋白免疫小鼠B细胞的反应,绘制了实验室初步测定的T和B细胞表位简图并进行了描述。结论： 1)M5-90疫苗免疫羊产生的SAT抗体持续时间短,水平低,而ELISA抗体长时期保持高位。 2)M5-90疫苗免疫可以诱导特异性T细胞免疫反应,在免疫后1个月达到高峰,随之快速下降,总体水平较低,持续时间较短。 3)M5-90疫苗免疫同时诱导Treg细胞增殖,抑制保护性T细胞免疫反应,可能是造成疫苗免疫保护效率低的原因之一。 4)筛选出10个BP26和OMP31的高频率共同性或优势表位多肽,5个品系特异性表位多肽和4个个体特异性表位多肽。 5)分析了实验羊MHC I和MHC Ⅱ DRB1Exon2等位基因的多态性与T细胞表位多肽反应的相关性。 6)制备了22株OMP31抗原单克隆抗体,50%为IgG2a,可识别线性,半构象和构象B细胞抗原表位。 7)揭示了5个OMP31的B细胞线性表位。 8)绘制了BP26与OMP31抗原T和B细胞表位简图。 9)实验结果对M5-90弱毒菌疫苗株分子改造提供了有意义的基础数据。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

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