CTLA4-Ig诱导大鼠供受体混合脾细胞的无反应性及其介导同种异体肾移植免疫耐受的实验观察

发布时间：2019-11-06 09:55

【摘要】： 背景和目的: 肾移植是目前治疗终末期肾脏疾病最有效的方法。成功的肾移植可使移植肾具有较高的长期存活率,术后患者的长期存活率和生活质量也高于透析患者。目前,肾移植技术已日趋成熟,影响移植肾存活率的主要因素是肾移植后排斥反应的发生。免疫抑制剂的问世虽然使肾移植取得了里程碑式的进步,但每天给予非特异性免疫抑制剂易引发二重感染、肿瘤等严重的并发症,绝大部分神经钙蛋白抑制剂尚有肾毒性作用。因此,诱导对移植物的免疫耐受是解决排斥的最理想方法[1],也是当今移植学界研究的热点。 肾移植排斥反应是由于T细胞的异常活化。T细胞的活化取决于第一信号与第二信号(共刺激信号)的共同作用,第一信号是抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC )提呈的抗原肽-MHC分子( major histocompatibility complex molecules-antigen,MHC-Ag)复合物与T细胞表面的受体(T cell receptor,TCR)结合;第二信号是T细胞表面的共刺激分子与APC表面的配体结合,包括B7-CD28/CTLA4、CD40-CD154等,其中最重要的是由抗原提呈细胞表面的B7分子与T细胞表面的CD28/CTLA4结合产生。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4,CTLA4)是细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)上的一种跨膜糖蛋白[3]。CTLA4可阻断B7/CD28共刺激信号通路,使接受了第一信号的异体抗原反应性细胞处于无反应状态,甚至于程序性死亡,使细胞增殖和分化成细胞毒淋巴细胞的作用受抑制,诱导淋巴细胞成为对特异性抗原无反应性的T细胞[1-4]。CTLA4-Ig是将CTLA4的胞外区与人IgFc段的CH2、CH3及γ区的氨基酸相结合而形成的一种融合蛋白,它仍保持与B7结合的生物学特性,却又具有了能溶于水和易于纯化的优点[15]。 目前,很多研究报道了无反应性T细胞在体内和体外具有特异性免疫抑制活性[5-7]。在人类骨髓移植中,使用无反应性T细胞能降低移植物抗宿主性[8-10,61]。因此,人们推测,应用体外产生的无反应性T细胞也能诱导人类实体器官的同种异体移植物的长期存活。本实验利用大鼠作为研究对象,应用CTLA4-Ig阻断B7/CD28共刺激通路制备无反应性T细胞,将无反应性T细胞通过尾静脉注射转移到肾移植受体,探讨无反应性T细胞对同种异体移植肾能否诱导免疫耐受的产生及其机理。为临床肾移植排斥反应的治疗寻找一种新的安全有效的方法。 方法: 1.大鼠脾细胞混悬液的制备[18]。 2.混合淋巴细胞反应:体外加入CTLA4-Ig到以SD大鼠脾细胞作为反应细胞和以Wistar大鼠脾细胞作为刺激细胞的混合淋巴细胞反应中培养,检测所得混合供受脾细胞有无增殖,没有发生增殖的为无应性T细胞。进一步检测这些无反应性T细胞在体外能否抑制同种异体活性T细胞反应,并检测无反应性T细胞的抑制作用能否被rIL-2逆转。 3.构建大鼠同种异体原位肾脏移植模型。 4.实验分组与输注细胞:将34只受体SD大鼠随机分为A、B、C、D四组,A组为实验组,B、C、D组为对照组。分组依据为受体输注的细胞种类,A组:输注(供体脾细胞+受体脾细胞+CTLA4-Ig)制备的4×107无反应性T细胞(10只);B组:输注4×107供受体脾细胞(10只);C组:输注(第三方脾细胞+受体脾细胞+CTLA4-Ig)制备的4×107无反应性T细胞(8只);D组:输注1mlPBS(6只)。 5.观察大鼠移植肾的存活时间及其组织病理变化:记录21只受体大鼠移植肾的存活时间;另13只肾移植术后第3、11、28、60天,每组每天取一只受体的移植肾制作光镜切片,观察组织病理变化,并做Banff系统综合评分[60]。 结果: 1.在供受体脾细胞的初级MLR中, CTLA4-Ig抑制了T细胞的增殖,随浓度增加抑制能力增强,增殖反应在CTLA4-Ig10μg/ml时被完全抑制。而PBS对照组的MLR发生了增殖。每个浓度的增殖值两两比较: p0.05,差异有统计学意义。 2.无反应性T细胞能抑制相同供受体脾细胞MLR的增殖,随无反应性T细胞/混合淋巴细胞的比率增高,其抑制作用增强。每个比率的增殖值两两比较: p0.05,差异有统计学意义。 3.加入rIL-2到无反应细胞和以供体脾细胞作为刺激细胞的次级MLR中,随rIL-2加入量的增加,其逆转作用增加。且高剂量的rIL-2(100 U/ml),引起了无反应状态的完全逆转。每个剂量的增殖值两两比较: p0.05,差异有统计学意义。 4.大鼠移植肾的平均存活时间比较:A组大鼠移植肾的平均存活时间(mean survival time,MST)为(102.0±92.0)天,较B组(10.6±2.3)天、C组(18.6±2.3)天和D组(8.0±1.8)天均明显延长(p均0.05)。 5.移植肾的组织病理变化:(1)肉眼观察: A组大鼠移植肾的大小基本正常,表面色鲜红,均匀、明亮;其它三组移植肾均有明显的肿胀和出血,体积增大,质坚而脆,表面呈深紫红色,呈“大红肾”。(2)光镜检查:A组大鼠移植肾间质仅见少量淋巴细胞及单核样细胞浸润,肾细小动脉无浸润,肾小球、肾小管基本正常。其它三组均出现急性细胞性或血管性排斥反应。(3)Banff系统综合评分: A组大鼠移植肾的总分值低于其它三组,组织学损伤较其它三组轻(p均0.05,有统计学意义)。 结论: 1.体外研究表明, CTLA4-Ig阻断B7/CD28共刺激通路能诱导无反应性T细胞的产生。 2.无反应性T细胞转移到同种异体移植受体后,能抑制大鼠肾脏同种异体排斥反应,延长移植肾的存活时间。
【图文】：

正常SD大鼠肾脏病理图片(HE染色×400)

无反应性T细胞组(HE染色×400)
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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