抗重组人内抑素单克隆抗体的制备、鉴定及检测人内抑素ELISA方法的建立

发布时间：2019-11-06 13:36

【摘要】： 目的制备抗重组人内抑素(Endostatin,ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定,建立双抗体夹心ELISA法用于人内抑素的检测。 方法利用重组人内抑素为抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人内抑素的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的Ig类别和亚型,Western-Blotting,免疫组化等实验鉴定其免疫学特性,通过Protein G Sepharose 4FF层析柱层析纯化抗体并进行标记。选择多抗和单抗最适包被浓度,对阴阳性血清稀释度的检测。 结果获得3B4、1D10、1G5、2D10四株能在体外多次传代培养后,稳定分泌抗重组人内抑素McAb的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价为10-6-10-4。并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3,另两株杂交瘤细胞的抗体亚型均为IgG2b。通过Western-Blotting和免疫组化证明单克隆抗体有识别ES蛋白的能力。通过Protein G Sepharose 4FF层析柱层析纯化,获得单一的峰值,并测的各个浓度。通过简易过碘酸钠法和戊二醛二步法酶标抗体,简易过碘酸钠法明显优于戊二醛二步法,简易过碘酸钠法效价可达到1:6400。利用单抗和多抗组成的双抗体夹心ELISA法能够区别出混合肿瘤病人血清与正常人血清中的ES含量。 结论本研究利用杂交瘤技术制备了四株抗重组人内抑素单克隆抗体,并进行鉴定,证明抗体识别ES蛋白有的一定得特异性和敏感性;后经protein G Sepharose 4FF亲和层析柱层析纯化,并进行辣根过氧化物酶过碘酸钠法标记单克隆抗体,通过直接ELISA法证明酶标抗体具有较高的效价。本研究通过自己制备的多抗和单抗组成的双抗体夹心ELISA法能够区别混合肿瘤病人血清与正常人混合血清,此结果为我们下一步的实验奠定了的基础,确定了方向。
【图文】：

4图11图11 四株单抗腹水经protein G Sepharose 4FF提纯后形成的各峰值4.4 酶标记抗体的效果测定 根据紫外分析仪测得结果，并计算，比较二种酶标方法，显示简易过碘酸钠法比戊二醛二步法优。见表-1

此为杂交瘤细胞，如箭头所指。其中图 1，为融合后第五天，图 2，融合后第十二天细胞生长情况。如图 不同时期的杂交瘤细胞形态(×40)图1 图2图1 箭头指为，在HAT培养液中生长的杂交瘤细胞.图2 单个细胞形成的集落Fig 1 Arrowhead shows, only hybridoma cell grow in the HAT culture.Fig 2 Cell lines generated by a single cell3.5 抗 ES 单克隆抗体的免疫球蛋白类别及亚型鉴定参照Sigma公司抗体亚型检测试剂盒说明书，采用Antigen-Mediated ELISA 法测定单克隆抗体的Ig类别和亚型。稳定分泌的细胞株分别是1D10、3B4，通过标准的免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒进行鉴定，分别为IgG3、IgG2a。1G5、2D10亚型均为IgG2b。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392;R446.6

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