泰素对调节性和效应性T细胞的不同作用及其机制研究

发布时间：2019-11-09 18:23

【摘要】：泰素是广泛应用于临床的一类抗肿瘤化疗药物,主要适用于卵巢癌,乳腺癌,非小细胞肺癌等肿瘤的治疗。泰素作为一种抗微管药物,主要通过促进微管蛋白聚合,抑制解聚,保持微管蛋白稳定,抑制细胞有丝分裂,从而达到抑制肿瘤增殖的目的。近些年来科学家们偶然发现,尽管泰素和LPS(脂多糖)的分子构象差异较大,但是泰素却可以模拟LPS与TLR4 (Toll like receptor 4)结合并活化其下游信号分子,促进一系列炎性因子的释放,泰素的这种作用先后于巨噬细胞、单核细胞等多种表达TLR4的固有免疫细胞中得以证实。随着对固有免疫分子TLR家族(TLRs)研究的深入,人们发现大部分TLRs(如：TLR2、4、6、7、8、9等)在适应性免疫细胞也有表达,其中包括CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)、CD4+T和CD8+T细胞等,并且其配体也可以激活相应的TLRs分子,引起细胞活化等一系列的级联反应。 我们实验室前期工作也发现TLRs在调节性T细胞上表达,并且发现泰素可以下调调节性T细胞的数量,同时结合文献,启发我们提出这样一个假设：泰素是否可以通过直接作用于调节性T细胞或效应性T细胞(Teff)表面的TLR4,来调节化疗过程中机体的适应性免疫应答,从而为寻找化疗后进行免疫治疗的有利时机提供新的方向。 因此,我们首先在体外检测了Treg和Teff表面的TLR4表达情况,以及泰素对Treg和Teff的作用,进一步应用TLR4突变小鼠(C3H/HeJ mice)和TLR4的RNA干扰技术验证泰素对这两种细胞亚群的影响是否是通过TLR4的途径,结果发现泰素对其作用与TLR4关系不大；然而,我们在后续的实验中发现Bcl-2是泰素作用于淋巴细胞的靶点,并进一步探讨了Bcl-2分子在泰素对Treg和Teff影响中的作用,尝试寻找化疗药物泰素对适应性免疫应答作用的新机制,为其临床应用提供相应的理论依据。 第一部分泰素对Treg和Teff细胞的不同作用 化疗药物泰素是临床肿瘤治疗的常见药物,然而其毒副作用之一,就是在杀伤肿瘤的同时往往使淋巴细胞减少。因此为了探讨化疗药物泰素对机体免疫系统的影响,我们用3LL肿瘤细胞株(小鼠非小细胞肺癌来源)建立了C57BL/6小鼠荷瘤模型,并以10mg/kg泰素腹腔注射进行治疗。第四天,处死小鼠并检测其脾脏淋巴细胞格局,我们发现CD4+CD25+Foxp3+T细胞亚群,即Treg细胞亚群比例明显减少。体外分离出T细胞经CD3/28 mAb刺激48小时后,使用不同剂量泰素处理24小时,结果显示Foxp3+细胞亚群也显著减少。这些现象说明化疗药物泰素可以减少Treg细胞亚群的比例。 其后,我们体外分离出Treg和Teff,分别用泰素处理,发现相同剂量泰素处理后的Treg细胞活力明显下降,而Teff变化不大。同时我们进一步检测了这两群细胞的细胞因子分泌功能,发现Treg的抑制性细胞因子分泌明显下降而Teff的分泌情况无变化；除此之外我们还检测了泰素处理后Treg的标志性分子Foxp3表达情况,发现其荧光强度也明显减弱。相同的实验同时也在未荷瘤的正常小鼠上进行,并且结果相似。以上实验结果表明,泰素可以选择性的作用于Treg而对Teff的影响不大,这有可能成为化疗后的生物治疗新途径。 第二部分泰素对Treg和Teff不同作用的机制研究 通过第一部分实验,我们观察到Treg和Teff胞对泰素的不同反应,于是我们开始探讨其不同反应可能的机制。最近几年来人们发现在适应性免疫细胞如Teff,Treg上都有固有免疫分子TLRs的表达,包括TLR4；而且泰素可以模拟TLR4配体LPS的作用,活化TLR4信号。因此我们推测：既然Treg和Teff两群T细胞都有TLR4的表达,那他们的表达情况是否相同,泰素是否可以通过TLR4的途径影响其功能,这种影响是否与我们的实验现象相一致。 于是我们通过MACS细胞分选得到Treg和Teff,观察其TLR4表达情况,无论是来源于3LL荷瘤C57BL/6小鼠还是正常C57BL/6小鼠,Treg细胞TLR4的荧光强度表达都比Teff强,这与文献报道相符。提示这两群细胞TLR4表达的差异可能是造成其对泰素的不同反应的原因。我们再次从3LL荷瘤C57BL/6小鼠和正常C57BL/6小鼠中分选Treg和Teff细胞,体外培养48小时后,加入泰素刺激,分别在12小时和24小时收集细胞,利用RT-PCR和流式细胞术检测TLR4在这两群细胞的表达,结果发现无论是在12小时还是24小时,在RNA和蛋白水平都未检测到TLR4在这两群细胞的明显变化。通过以上实验我们并未发现TLR4被激活,因此我们又使用了C3H/HeJ小鼠(C3H/HeJ小鼠的TLR4基因位点突变,LPS刺激其不会引起TLR4信号的传导以及炎性细胞因子的分泌)末进一步验证以上实验结果。我们采用腹腔注射泰素10mg/kg,对照组腹腔注射PBS,4天后处死小鼠,取其脾脏并检测其CD4+CD25+Foxp3+细胞比例,结果发现无论是C57BL/6小鼠还是C3H/HeJ小鼠,与对照组相比,其Treg比例都有明显下降,但二种系小鼠实验组之间无统计学差异；体外细胞因子分泌和细胞活力检测均得到相似结果,即泰素对C57BL/6和C3H/HeJ小鼠的作用相同。除此之外,我们还利用PEI试剂体内转染的方法,对C57BL/6小鼠腹腔注射si-RNA-TLR4质粒来沉默小鼠TLR4的表达,然后注射10 mg/kg泰素,4天后观察小鼠体内Treg的变化,结果仍然与C57BL/6小鼠、C3H/HeJ小鼠相似,其Treg比例明显下降。因此,该部分结果显示泰素对Treg和Teff细胞的不同作用并不是由于其TLR4表达的不同所引起,可能存在其它机制。为了进一步寻找泰素对Treg和Teff不同作用的机制,我们首先利用MACS分选出Treg和Teff细胞,CD3/CD28活化48小时,之后加入泰素处理24小时,AnnexinⅤ/PI试剂盒检测细胞凋亡,结果显示Treg细胞凋亡较Teff明显。该结果同时在DAPI染色试验中得到验证,Treg细胞核形态发生明显的凋亡改变。这提示泰素对Treg和Teff作用不同的机制可能是由于两种细胞对凋亡刺激敏感性的差异所引起。 泰素杀伤肿瘤的作用主要是抑制微管解聚,终止肿瘤细胞有丝分裂,诱导细胞凋亡,因此我们需要验证泰素诱导Treg凋亡是否是通过对微管的作用所介导。因此,我们将MACS分选出的Treg和Teff细胞,经CD3/CD28活化48小时,然后泰素作用24小时,将两群细胞按照实验组、对照组分别制成细胞涂片并固定,然后进行免疫荧光染色,用FITC-anti-a-tubulin标记微管蛋白,用DAPI标记细胞核,然后用荧光共聚焦显微镜观察细胞微管变化,结果显示泰素处理前后其微管未发生显著性变化,说明本研究所用剂量的泰素对Treg细胞的凋亡作用主要不是通过抑制微管的解聚,终止细胞有丝分裂所致。 由于泰素可与抗凋亡家族的主要分子Bcl-2的特异性位点结合,调节肿瘤细胞的凋亡,因此我们推测泰素是否可以通过作用于Treg上的Bcl-2分子来调控其凋亡。用Western Blot对Bcl-2进行检测,发现泰素作用24和48小时,均可以显著下调Treg的Bcl-2表达,而对Teff细胞没有影响。同时,我们检测了Bcl-2家族的另一个促凋亡分子Bax,观察其是否参与了这一过程,结果表明泰素作用后Treg细胞Bax的表达上调而Teff细胞变化不明显。该家族的另外一个抗凋亡分子Bcl-xl经检测在这两群细胞中都没有明显改变。 为了进一步验证Bcl-2参与了泰素选择性诱导Treg细胞凋亡的作用,我们应用了Bcl-2抑制剂(ABT 737),阻断抗凋亡分子Bcl-2的通路,来证明该机制的正确性。实验结果显示,在加入阻断剂后,与对照组相比,泰素丧失了其选择性诱导Treg细胞凋亡的作用,而对Treg和Teff细胞的无影响。因此,通过这一部分的实验我们证明了泰素对Treg和Teff细胞的不同作用是通过Bcl-2的通路,一定剂量的泰素可以下调Bcl-2的表达,从而使其凋亡增加；而对Teff Bcl-2表达无影响。 综上所述,本研究阐明了化疗药物泰素在一定剂量下可以选择性作用于Treg细胞使其凋亡,而对Teff细胞没有作用,这种现象并不是通过TLR4途径或干扰其微管蛋白,而是由于泰素可以下调Treg细胞抗凋亡分子Bcl-2,同时上调Bax蛋白的表达,而对Teff细胞无影响。
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2.泰素对Trcg和Teff细胞活力的影响为了进一步研究泰素对Treg和Teff细胞的影响，我们用磁珠分选的方法分离3LL荷瘤小鼠脾脏的Treg和Teff细胞，纯度达93%以上，如图1.2(A)。Treg和Teff细胞用 CD3/28mAb刺激48小时，然后分别与0.1抖M、l抖M泰素共培养24h，收集细胞，苔盼蓝计数细胞活力。结果发现泰素处理后的Treg细胞活力明显降低，而Teff细胞活力无明显变化(P<0.05)(图1.2)。我们在正常小鼠的实验中得到同样结果(图1.2)Treg :::::::， ，，云 云一一::介介，，一崖‘”‘一肿几 叮---93.86叨，亡叼OO...CC盯匕口01洲C二1洲乃的邪。

本文编号：2558607