HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察

发布时间：2019-11-11 13:30

【摘要】：目的 构建2型单纯疱疹病毒载体疫苗，检测重组载体疫苗的免疫效果，为获得预防和治疗2型单纯疱疹病毒慢性感染的重组载体疫苗奠定理论基础，为2型单纯疱疹病毒疫苗的研制提供一种新的策略。完善耻垢分枝杆菌载体疫苗构建技术，为其作为病毒疫苗制备平台提供技术支持。 方法 1、pmv261-gBD-570质粒的构建 查阅文献，根据GeneBank中登记的HSV-2gD和gB的基因序列构建gBD-570，将含有EcorI和salI酶切位点的gBD-570亚克隆入载体puc57，经鉴定正确后，，同时酶切穿梭质粒PMV-261和puc57-gBD-570，并将酶切片段gBD-570回收后亚克隆入酶切后的穿梭质粒PMV-261中，构建重组质粒pmv-gBD-570，经提质粒，酶切和菌落PCR鉴定正确后提取重组质粒，-20℃保存备用。 2、目的基因gBD-570的蛋白表达 将提取的质粒通过电穿孔亚克隆入耻垢分枝杆菌（MC2155），用SDS-PAGE方法鉴定gBD-570的表达。 3.免疫动物 6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为6组（每组10只），于小鼠双侧股四头肌注射免疫，各组依次为：1组，每侧各注射NS（生理盐水）200μl；2组，每侧各注射空载体质粒PMV261200μl（1mg/ml）；3组，每侧各注射1×106cfu/ml的MC2155200μl（1mg/ml）；4组，注射低浓度（1×104cfu/ml）的重组MC2155200μl；5组，注射中浓度（1×106cfu/ml）组的重组MC2155200μl；6组，高浓度（1×108cfu/ml）组的重组MC2155200μl。免疫完成三周后，于小鼠断尾采血，间接ELISA法检测血清IgG、IFN-γ及IL-2表达量，并通过MTT法对小鼠的脾淋巴细胞增值率进行检测 结果 1、构建重组质粒PMV-gBD-570转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、双酶切以及测序鉴定正确，质粒构建成功。 2、将构建成功的质粒电穿孔转化入耻垢分枝杆菌MS中，经菌落PCR及双酶切鉴定正确，质粒转化成功。 3、SDS-PAGE结果显示，重组质粒可以在MS中正确表达 4、免疫小鼠后实验结果显示：中浓度组重组MC2155和高浓度组MC2155的免疫效果均优于其他实验组，能够较好的诱导体液免疫及细胞免疫。 结论 1、成功构建了融合蛋白表达载体PMV261-gBD-570 2、重组表达载体在耻垢分枝杆菌中获得了有效表达 3、重组耻垢分支杆菌能够较好的诱导小鼠体液免疫和细胞免疫，为下一步的疫苗制备工作奠定了基础。
【学位授予单位】：泰山医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2559282