氧化高密度脂蛋白对体外培养的兔树突状细胞的成熟与趋化因子MCP-1分泌的影响

发布时间：2019-11-11 11:21

【摘要】： 冠心病(coronary heart disease,CHD)是最常见的心脑血管疾病之一,其发病率逐渐增高,1998年至2008年间,我国男性冠心病发病率较以往同期约增加26%,女性约增加19%,其死亡率也呈迅速上升趋势,是我国居民死因构成中上升最快的疾病,已成为威胁我国公众健康的重要疾病,如何有效防治是医疗行业和社会关注的重点。但是CHD的发病机制至今仍不完全明了,成为阻碍其治疗进展的主要难题。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是CHD的主要病理基础。以往关于AS形成的机制主要围绕三种学说:脂质沉淀学说、损伤修复学说和血栓形成学说。高血压、吸烟、血脂异常、糖尿病、超重和肥胖、年龄、性别、高半胱氨酸血症以及高尿酸血症等导致血管内皮损伤和脂质沉积的内在因素,被认为是CHD发病的高危因素。远离这些危险因素,或者控制这些因素的恶化,均可在一定程度上取得预防AS发生发展的效果。近年来,随着急性冠脉综合症(acute coronary syndrome,ACS)这个CHD的急性进展阶段的界定,使得人们重新认识了CHD发展阶段的病理和病理生理特点。ACS的病理基础是易损斑块,研究发现易损斑块伴随着大量炎症细胞和免疫细胞的介入,是斑块不稳定和容易破裂的主要原因;ACS患者存在全身炎症因子和炎症反应活化的情况。进一步研究发现AS的所有阶段都有免疫细胞的介入,于是提出CHD是一种慢性炎症和自身免疫性疾病这一新观点,认为内在或外在危险因素导致的炎症和免疫反应是AS发病的基础。自1973年Steinman和Cohn发现树突状细胞(Dendritic cells,DCs)以来,大量研究证明,DCs是免疫过程中起负责抗原呈递的细胞,是机体内功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)。极少量的DCs即可强烈激活T淋巴细胞启动特异性细胞免疫反应,在免疫应答的诱导和调节中起重要作用。最近研究证实DCs在AS病变中聚集明显增加,与T淋巴细胞共同出现在AS的病变薄弱部位,使得人们推测DCs在AS的发生发展中可能同样起着启动炎症和免疫反应的作用,而采取他汀类药物干预AS患者的DCs可以抑制其免疫活性,可能在AS的免疫调节治疗中起作用。进一步研究需要在AS模型中观察DCs的作用。鼠、兔的动脉粥样硬化模型是目前广泛应用于AS研究的动物模型之一,DCs的研究其细胞来源主要是人外周血、骨髓、脐血或者是鼠骨髓源的单核细胞。Virginia采取人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony stimulating factor,hGM-CSF)与人白细胞介素-4(human interleukin-4,hIL-4)刺激培养兔骨髓源性树突状细胞成功则提供了DCs细胞培养的新的选择。血脂的改变在AS的形成中起着非常重要的作用。高密度脂蛋白(highdensitv lipoprotein,HDL)具有抗动脉粥样硬化的作用,低HDL水平是冠心病发病的危险因素之一。目前认为HDL抗动脉粥样硬化的作用主要是由其逆转运胆固醇的功能密切相关,HDL逆转运胆固醇由其载脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,apoA-I)结合到细胞膜上的ATP结合盒转运体Al(ATP-binding cassettetransporter A1,ABCAl)介导。最近的研究发现HDL在体内可以被内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞氧化修饰,HDL被氧化修饰后发生结构改变,导致结合和通过ABCAl转运胆固醇的能力下降,而且具有细胞毒性作用,从而促进AS发生。趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子,趋化因子结构和功能相似,分子量多在8-12KD之间,对嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等多种细胞均有趋化作用。近年来,趋化因子及其受体的研究越来越受到重视,已经证明它们在机体发挥重要的生理和病理效应,在炎症、肿瘤、自身免疫病、变态反应、AIDS等疾病中均有趋化因子及其受体的参与,重组趋化因子、趋化因子及其抗体的拮抗剂已经进入临床研究,成为新的生物治疗热点。 DCs作为目前已知功能最强的专职抗原呈递细胞,是否能吞噬和捕获ox-HDL并向T细胞提呈抗原,以及ox-HDL对Des的成熟及其趋化因子单核细胞趋化蛋白-l(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)与巨噬细胞炎性蛋白-1a(macrophage inflammatory protein-1a,MIP-1a)分泌的影响,目前研究尚不明了。本课题分为两个部分,第一部分研究在hGM-CSF+hIL-4作用下体外培养。诱导兔外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)以及骨髓单个核细胞(bone marrow monouclear cells,BMMC)转化为Des的方法,并采取LPS诱导DCs的成熟,旨在为AS的组织工程和临床细胞诊断、治疗的研究奠定基础。第二部分利用荧光染料DiI标记ox-HDL,在体外观察Des对其的捕获过程及ox-HDL诱导Des成熟情况,探讨ox-HDL对Des成熟的影响,并利用ELISA方法,在体外观察ox-HDL对DCs趋化因子MIP-1a和MCP-1分泌,为进一步研究ox-HDL抗原呈递机制及动脉粥样硬化形成机制研究奠定基础。其结果分述如下: 1兔PBMC源性及BMMC源性DCs体外培养的研究通过密度梯度离心的方法收集到的单只兔外周血20mL转化为DCs的数量约为10-20×10~6,单只兔骨髓液10mL转化为DCs的数量约为5-10×10~6。 1.1细胞的形态学结果培养第2天对照组细胞粘附于聚苯乙烯培养瓶底部,DC组的细胞部分在培养基中悬浮生长,细胞较小,形念无明显差别。培养第6天对照组的细胞呈圆形或椭圆形,粘附于培养瓶瓶底,扫描电镜下细胞呈圆形及椭圆形,表面有小杆状突起;DC组的细胞悬浮生长,可见部分细胞聚集成簇,细胞表面可见数量不等、形态不一的树突样突起,扫描电镜下细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起。 1.2细胞的流式细胞学表型分析结果培养6天后外周血源性DC组与骨髓源性DC组的细胞MHCⅡ、CD86高表达,CDl4低表达。相同来源的不同细胞各组间行独立样本t检验:外周血源性DC组与外周血源性对照组的MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异有显著性意义(p＜0.001),骨髓源性DC组与骨髓源性对照组MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异有显著性意义(p＜0.001)。不同来源的同类细胞行各组间行独立样本t检验:外周血源性DC组与骨髓源性DC组的MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异无显著性意义(p＞0.05),外周血源性对照组与骨髓源性对照组的MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异无显著性意义(p＞0.05)。析因设计资料的方差分析提示不同标本来源的细胞问比较差异无显著性意义(p＞0.05),不同刺激方法培养的细胞间比较差异有显著性意义(p＜0.001)。 1.3吞噬功能检测成熟DCs的吞噬功能下降,主要表现为抗原呈递功能,为此用流式的方法比较巨噬细胞和成熟DCs在37℃条件下对FITC—dextran的摄取能力的差异。析因设计资料的方差分析提示不同标本来源的细胞间比较差异无显著性意义(p＞0.05),不同刺激方法培养的细胞间比较差异有显著性意义(p＜0.001)。两组间独立样本t检验结果显示,外周血源性DCs组和骨髓源性DCs组细胞吞噬能力表达较低,两种来源的对照组细胞吞噬能力表达较强。外周血源性DC组与骨髓源性DC组之间、外周血源性对照组与骨髓源性对照组之间比较差异无显著性意义(p＞0.05),外周血源性DC组与外周血源性对照组之间、骨髓源性DC组与骨髓源性对照组之间比较差异有显著性意义(p＜0.001)。 2 ox-HDL对兔PBMC源性DCs的成熟及趋化因子分泌的影响 2.1 DCs的培养和观察倒置相差显微镜下:培养第2天各组细胞部分在培养基中悬浮生长,细胞较小,圆形。培养第5天细胞悬浮生长,可见部分细胞聚集成簇,细胞形态不规则,表面可见数量不等、形态不一的树突样突起,细胞质变得丰富。加入50μg/mLHDL、ox-HDL后,细胞形态无明显改变,细胞大部分悬浮或半贴壁,少数贴壁。 2.2 DCs对DiI标记的ox-HDL的加工处理和抗原呈递 DCs与DiI标记的ox-HDL混合孵育2小时,荧光显微镜观察显示原本无色的DCs,在摄取了经DiI标记的ox-HDL后,胞浆也变的红染,培养2天后,这种情况则显示更为明显。DiI良好显示DCs摄取ox-HDL抗原和成熟过程。DCs开始为较小的幼稚多形细胞,其摄取抗原过程清晰可见,在摄取抗原后逐渐发育变大,胞浆逐渐丰富,变为不规则多型状态,并有较多伪足伸出。 2.3 ox-HDL对DCs表型的影响收集干预48h的悬浮细胞,经FACS分析显示,与阴性对照PBS组相比,经HDL及ox-HDL处理的DCs其表面分子CD86和MHCⅡ的表达均上调,CDl4的表达均下调。行One-Way ANOVA检验,MHCⅡ、CD86、CDl4(CDl4方差不齐,采用Welch法校正)在各组间差异有显著性意义(p＜0.001)。Dunnett'sT3多重比较提示HDL组与PBS组的MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异无显著性意义(p＞0.05),ox-HDL组与PBS组之间(p＜0.001)、ox-HDL组与HDL组之间(P＜0.01)的MHCⅡ、CD86、CDl4比较差异均有显著性意义。 2.4与ox-HDL共同培养的DCs上清液趋化因子MIP-1a和MCP-1检测结果: 上清液趋化因子MIP-1a的ELISA检测结果进行析因设计资料的方差分析提示:时间因素对上清液的MIP-1a表达量的影响有显著性意义(F=34.520,p＜0.001),分组因素(培养环境中的干预因素)对上清液的MIP-1a表达量的影响无显著性意义(F=0.722,P＞0.05)。继续行One-Way ANOVA检验显示不同时间段的MIP-1a表达量不同,多重比较显示除HDL组在24小时与48小时之间差异无显著性意义外(P=0.102),其余各时间段之间的两两比较,其MIP-1a表达量差异均有显著性意义(p＜0.05),但是不同分组,即按不同干预条件对各时间段的上清液MIP-1a表达量影响均无显著性意义(p＞0.05)。上清液趋化因子MCP-1的ELISA检测结果进行析因设计资料的方差分析提示:时间因素对上清液的MCP-1表达量的影响有显著性意义(F=31.481,P＜0.001),分组因素对上清液的MIP-1a表达量的影响有显著性意义(F=47.931,p＜0.001)。继续行One-Way ANOVA及Dunnett's T3多重比较提示:不同时间段的MCP-1表达量不同,除PBS组在12小时与24小时之间差异无显著性意义外(p=0.383),其余各时间段之间的两两比较,MCP-1表达量差异均有显著性意义(p＜0.001)。不同分组,即不同干预条件对各时间段的上清液MCP-1表达量影响差异有显著性意义(p＜0.001),多重比较显示ox-HDL的影响与其他因素单独比较,在各时间段的差异均有显著性意义(P＜0.05)。通过上述两个章节实验,我们总结以下结论和创新: (1)兔PBMC及BMMC均能在hGM-CSF+hlL-4的作用下经过5天的培养被诱导分化为DCs,但PBMC源性的DCs表型表达的阳性率高于BMMC源性的DCs。经过LPS的作用,两种来源的DCs均能转化为成熟树突状细胞; (2)体外培养的兔PBMC源性DCs经过ox-HDL的干预,其CD86、MHCⅡ表达上调,CDl4表达下调,符合成熟DCs的特征。 (3)通过DiI荧光染料从形态学上对DCs摄取ox-HDL的过程显示DCs摄取ox-HDL和成熟过程,进一步证实ox-HDL可以被DCs识别,并通过受体摄取、内吞入胞浆中。 (4)兔DCs经过ox-HDL的干预,可以增加DCs分泌MCP-1。 (5)ox-HDL对DCs趋化因子的影响使得DCs迁徙变化,可能参与动脉粥样硬化的形成。
【图文】：

柱状图,流式,柱状图,骨髓

源性DC组之间、外周血源性对照组与骨髓源性对照组之间比较差异无显著性意义(尸)a05)，外周血源性DC组与外周血源性对照组之间、骨髓源性DC组与骨髓源性对照组之间比较差异有显著性意义(尸灯 a001)。(表1一3，图1一5，1一6)表l一 3Dextron吞噬实验流式分析结果(%，丁土·)Tab.l一 3PhenotyPeanalysisofuPtakeofdextranPBMC(n=12)BMMC(n=12)Sum(n=24)之产，，PDC(n=12)27.33士 9.1123.60士 11.5425.47士 10.341.1反歹(t)0.245对照(n二12)72.57士 15.2275.72士 15.4774.14士 15.230.376(t夕汉710Sum(n二24)49.95士 26.16049.66士 29.8549.81士 27.760.00扩厂刀 0.94口之布一189‘t)一Z只灸歹‘t)163.匆夕‘万夕尸，欲818 P0.0000.O0O0.OOJP八二0

抗原,胞浆,抗原呈递,多型

2.2.2DCs对DII标记的OxHDL的加工处理和抗原呈递DCS与DII标记的ox一HDL混合孵育2小时，荧光显微镜观察显示原本无色的DCs，在摄取了经DII标一记的ox一HDL后，胞浆也变的红染(图2一IA)，培养2天后，这种情况则显示更为明显(图2一IB)。1)11良好显示DCs摄取ox一HDL抗原和成熟过程。DCS开始为较小的幼稚多形细胞，其摄取抗原过程清晰可见，在摄取抗原后逐渐发育变大，胞浆逐渐丰富，变为不规则多型状态，并有较多伪足伸出。图2一 1DCS对DII标记的ox一HDL的摄取(K200) F19.2一 1DII一ox一 HDLuPtakenbyDCs(X200)
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】