【摘要】：肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生素为阳离子型。如动物的防御素(Defensins)即为一组阳离子型肽抗生素,它首先从兔的中性粒细胞中发现,而后发现在不同动物的巨噬细胞、小肠paneth细胞、上皮细胞中也有表达,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种功能。根据半胱氨酸的分布及形成二硫键的方式不同,哺乳动物的防御素分为α-,β-和θ-三个亚家族。人的防御素分子中均含有6个半胱氨酸,可形成3对二硫键。迄今已发现17种人防御素,包括6个α-防御素(HNP1-4,HD5和HD6)和11个β-防御素(HBD1-6和HBD25-29)。它们在人体遭受感染后,机体的特异性免疫建立之前发挥重要作用。在临床耐药菌问题日益严重、病毒感染又缺乏特异性治疗手段的今天,肽抗生素的发现及深入研究无疑给临床抗感染治疗点燃了新的希望。 肽抗生素hPAB-β为人hBD-2的一种突变体,在我们的前期工作中通过删除hBD-2N-端三个氨基酸,在C-端添加了一个天冬酰胺获得,具有hBD-2相似的抗菌活性。在前期工作中,我们利用铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因编码的PaP3.30蛋白作为承载分子对hPAB-β进行了融合表达,融合蛋白的表达率达到细菌总蛋白的40%,但该融合蛋白的分子量(23.6 kDa)是目标肽hPAB-β(4.3 kDa)的5倍多,故实际的hPAB-β表达量不到7%,表达效率不高；后来采用串联体的方法(即将hPAB-β基因头尾相连,构建不同拷贝数的表达载体),但由于一个hPAB-β中就含有6个半胱氨酸,串联的分子越多,二硫键的形成越复杂,融合蛋白形成的包涵体溶解性越差,难以实现hPAB-β的高效制备；最后根据毕赤酵母系统表达外源蛋白产量高及可进行分泌型表达的特点,我们成功构建并实现了肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的分泌型表达,目标多肽的产量达到241.2±39mg／L,本论文报道了酵母高密度发酵肽抗生素hPAB-β的纯化,以及在获得高纯度hPAB-β后,以单纯疱疹病毒为模型,探讨了hPAB-β对疱疹病毒的杀灭作用,主要实验方法和结果如下： 利用毕赤酵母易于高密度发酵的特性,在3.7L发酵罐中对重组了肽抗生素hPAB-β表达盒的pPIC9K-hPAB-β/GS 115酵母优5工程菌进行高密度发酵,在菌体达到一定生长量后,用甲醇诱导目标基因的表达,并对菌体生长曲线、目标蛋白的表达水平进行了监测。从生长曲线中可见,在种子接种后的16h内,酵母菌生长迅速,加入补料后,酵母菌继续生长,在生长32h(菌体湿重达236.7±25.3g／L)时停止补料,菌体生长速度下降,在甲醇诱导期间,菌体生长缓慢。在诱导过程中,间隔8-12h取样进行Tricine SDS-PAGE电泳分析,结果可见,在刚开始诱导时,上清中未见目标肽分泌,加入诱导剂12h后,隐约见有表达条带,尔后表达带逐渐增强,到诱导60h下罐时达到最高。用Brandford法测得3次发酵液的总蛋白浓度分别为664.0 mg／L,781.8 mg／L和721.3mg／L。用Bio-Rad公司Quantity One软件条带检测灰度分析工具对凝胶电泳后的蛋白条带进行分析,目的蛋白约占发酵上清液总蛋白的33.4%,故可知发酵上清中目的蛋白的表达量约为241.2±29.5 mg／L,实现了重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β的目标。 纯化的目的不仅仅是要获得高纯度的目标产物,还要使目标产物的生物学活性在纯化过程中不丧失,这就要根据目标分子与杂质的差异设计纯化路线,经过试验摸索加以优化。考虑到hPAB-β为一阳离子小肽(pI 9.001),我们设计了10kDa膜过滤、反相层析、阳离子交换、分子筛脱盐等纯化技术对目标肽进行纯化,最终从每升发酵液中纯化得到74.9±1.5 mg目标蛋白,纯度达到98%以上,总体纯化效率为31.5%,实现了酵母表达肽抗生素hPAB-β的分离纯化。获得纯化的hPAB-β后,我们利用Western blot对目标肽进行了鉴定,目标产物能与hPAB-β的特异性抗体反应,表明纯化出的蛋白即为需要的目标物。进一步利用琼脂扩散法检测了纯化产物对革兰阴、阳细菌的杀灭活性,结果表明纯化产物具有生物学活性,为进一步开展hPAB-β的功能研究奠定了基础。 病毒分离培养和分型是生殖器疱疹实验室诊断的“金标准”,通常需时2-4天,然而不同的标本类型对培养结果干扰较大。随着基因组学的进展,单纯疱疹病毒的基因组全序列均已清楚,为分子生物诊断技术(PCR、核酸探针等)在单纯疱疹病毒感染诊断中的应用奠定了良好基础。为研究肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性,我们以单纯疱疹病毒为模型,采集了60例临床上疑似生殖器疱疹患者病变部位的标本进行病毒分离培养,并根据单纯疱疹病毒DNA多聚酶基因序列合成了型特异性PCR引物,对临床标本进行PCR检测,并与细胞培养进行了对比分析。结果60份疑为生殖器疱疹患者的标本经HSV型特异性PCR检测,有45份可见约390bp的特异性扩增产物(HSV-2),阳性率75%,而HSV-1特异性引物检测为阴性；利用Vero细胞进行病毒分离培养,结果阳性36例,阳性率60%,和PCR检测相比,差异非常显著(X2=24.38,P0.01)。从患者皮损的类型来看,水疱和脓疱标本的病毒培养和PCR检测阳性率均较高(80-93.3%),糜烂、结痂、斑丘疹标本检测阳性率较低,尤以斑丘疹最低,提示对疑为生殖器疱疹病人作病原学诊断,采集水疱、脓疱标本进行病毒分离或PCR检测较佳。 利用重组毕赤酵母工程菌pPIC9k-hPAB-β/GS115进行高密度发酵、纯化,制备肽抗生素hPAB-β。采用稀释法检测了重组hPAB-β对Vero细胞的毒性,结果显示高浓度的肽抗生素hPAB-β(1 mmol/L以上)对细胞有毒性,其对Vero细胞的最大无毒浓度为400μmol/L,约1.72mg/ml。以临床标本中分离的HSV-2为研究对象,将肽抗生素hPAB-β作用于HSV-21.5h后接种细胞,结果可见各实验稀释度(400-10μmol/L)的肽抗生素都有抑制病毒噬斑形成的能力,随着肽抗生素浓度的升高,噬斑形成数减少,表明经酵母高密度发酵的肽抗生素hPAB-β对临床分离的HSV-2有直接杀灭作用。病毒液对照(100TCID50的病毒液0.2ml+PBS 0.2m1)在培养20h时即开始出现细胞病变,培养2d后,对培养孔用1%结晶紫(含10%甲醛)染色,记数平均噬斑形成数目为101.7±5.5个。在同等实验条件下,阿昔洛韦的高浓度孔才能见其病毒抑制效应,在浓度降低至100μmol/L以下时,病毒噬斑形成数没有明显改变。基于此,选用浓度为200μmol/L肽抗生素hPAB-β和阿昔洛韦的抗病毒活性进行对比分析,以病毒对照组的噬斑形成率为100%,则肽抗生素hPAB-β作用组的噬斑形成率为48.7%；200μmol/L阿昔洛韦作用组的噬斑形成率为39.0%；与病毒对照组相比,两个药物作用组的病毒噬斑形成都有显著降低(P值分别为0.02545和0.0103),肽抗生素作用组与阿昔洛韦药物对照组相比,噬斑形成率略高(前者48.7%,后者39.0%),但两者无统计学意义(P=0.06927)。表明肽抗生素hPAB-β对HSV-2具有良好的杀灭活性。 综上所述,利用重组毕赤酵母高密度发酵,肽抗生素hPAB-β的表达量达到241.2±29.5 mg／L,经10kDa膜过滤、反相层析、离子交换、分子筛层析等处理,从酵母发酵上清中纯化得高纯度目标产物74.9±1.5 mg／L,总体纯化效率为31.5%,该纯化产物具有杀灭革兰阴、阳性细菌的能力。采用PCR、病毒分离培养对60例疑似生殖器疱疹患者的标本进行检测与鉴定研究,有45份PCR扩增产物阳性,阳性率75%,均为HSV-2,而HSV-1型特异性引物的检测为阴性；用Vero细胞进行的病毒分离培养,结果36例阳性,阳性率60%,和PCR检测相比,差异非常显著。利用病毒噬斑计数法对肽抗生素hPAB-β的抗病毒活性进了分析,结果在200μmol/L hPAB-β或阿昔洛韦时的作用下,前者的病毒噬斑形成率为48.7%,后者为39.0%,与病毒对照组相比,两者均显著下降,而肽抗生素hPAB-β与阿昔洛韦组相比,对病毒噬斑形成的抑制无显著差异(P=0.06927),表明经酵母表达纯化的肽抗生素hPAB-β具有抗HSV-2的活性,为深入分析其抗病毒机制提供了实验依据。
【图文】：
均能很好表达目的条带，表明所构建的肤抗生素hRAB一p重组毕赤酵母pPIcgK~hPAB一p/GSI巧优5菌株遗传学稳定。图1-Figurel一l重组毕赤酵母ppICgK一h狱B一p/05115优5菌株的筛选 ResereeningofreeombinantPPICgK一hPAB· p/GSI15strainyou一52、重组毕赤酵母高密度发酵将重组的优5菌株接种于Zooml的BMGY培养基中，，30℃培养至作为种子菌，酵物约5ml，而后接种于发酵罐进行高密度发酵，检测溶氧与pH，每隔测定OD值，并取lml悬液离心沉淀，上清留取电泳分析，OD6o。为6一88一12h取发称出沉淀的
第三军医大学硕士学位论文重量，计算发酵过程中每升发酵液中菌体的湿重，并对时间作图，得到如图1一2所示的生长曲线(3次发酵的参数)。从图中可见，在种子接种后的16h内，酵母菌生长迅速，加入补料后，酵母菌急速生长，在生长32h(菌体湿重达236.7土25.3留L)时停止流加补料，菌体生长速度下降，在诱导期间，菌体生长缓慢。在发酵过程中，间隔8一12h取样进行Tricine一SDS一PAGE电泳分析，结果见图1一3。从图中可见，在刚开始诱导时，上清中未见目标肤分泌，加入诱导剂12h后
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346
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本文编号：
2559650
