胚胎后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞向肾脏细胞分化的实验研究

发布时间：2019-11-12 15:00

【摘要】： 目的: 胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)由于具备强大的自我更新及多向分化潜能等特性,可作为再生医学中种子细胞的新来源,受到广大学者的普遍关注。有关ESCs向肾细胞诱导分化的研究起步相对较晚,近年才见部分报道。体外研究表明,ESCs经特定的细胞因子诱导可向一定类型的肾细胞分化;体内研究表明,后肾细胞微环境在诱导ESCs向肾脏细胞分化过程中起重要作用。本研究通过体外共培养方式模拟后肾细胞微环境,探讨其对ESCs向肾细胞方向分化的诱导作用,为研究ESCs向肾系细胞分化提供新的实验模式,并为探索后肾细胞微环境中影响ESCs向肾系细胞分化的关键因子打下实验基础。方法: 1.以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养小鼠D3系ESCs,RT-PCR法鉴定多潜能标志基因Oct4、Nanog和Sox2的表达。 2.通过悬滴法将ESCs制备成拟胚体(Embryoil Bodies,EBs),将EBs分为共培养组和自然分化组。共培养组:通过Transwells系统将EBs与孕12.5天的胎鼠后肾细胞进行间接接触共培养;自然分化对照组:常规方法培养EBs,令其自然分化。 3.采用免疫荧光细胞化学染色法观察后肾细胞微环境对EBs表达肾小管细胞标志物Pax2和肾足细胞标志物WT1的影响。 4.采用RT-PCR方法观察胚胎后肾细胞微环境对EBs表达肾脏发育相关基因(Pax2、WT1、GDNF、Emx2、BMP-7、Nephrin和KSP)及肾祖细胞标志CD24基因的影响。结果: 1.ESCs在饲养层细胞上呈集落样生长,RT-PCR结果显示其多潜能标志基因Oct4、Sox2、Nanog强表达,说明用于本实验的ESCs处于未分化状态。 2.免疫荧光细胞化学染色结果显示,共培养组EBs第3天即可见Pax2阳性细胞,且随着共培养时间延长, Pax2阳性细胞逐渐增多,且可见部分阳性细胞成簇排列,形态类似圆环状,而自然分化组EBs于第7天见少数Pax2阳性细胞,经统计分析,共培养组Pax2阳性细胞数显著高于自然分化组(P0.05);共培养组EBs第3天即可见WT1阳性细胞,且随着共培养时间延长,WT1阳性细胞逐渐增多,而自然分化组EBs未见WT1阳性细胞。表明间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可促进ESCs向肾小管细胞和肾足细胞分化。 3.RT-PCR结果显示,与自然分化组比较,共培养早期,后肾细胞微环境可促进后肾发育早期基因(Pax2、WT1)、后肾发育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)及肾祖细胞标志CD24基因的表达,随着共培养时间的延长,后肾发育晚期基因(Nephrin、KSP)的表达增强,而后肾发育早期基因(Pax2、WT1)及后肾发育中期基因(Emx2、GDNF、BMP7)的表达减弱。提示间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可调控ESCs表达后肾发育相关基因。结论: 间接接触共培养方式模拟的胚胎后肾细胞微环境可诱导ESCs向肾系细胞分化,并可调控后肾发育相关基因的表达。
【图文】：

模型图,细胞培养,模型

图 2-1 各组细胞培养模型2.2.5.2 细胞免疫荧光染色分析 Pax2、WT1 蛋白的表达细胞免疫荧光染色法检测不同时间点 EBs 细胞中后肾发育相关蛋白 Pax2、WT1 的表达。主要步骤包括：分别在后肾细胞诱导第 3、5、7 天，轻轻吸除 12孔板中培养液，PBS 清洗 EBs 细胞一遍后，以 4%多聚甲醛/PBS 室温固定 15分钟，PBS 洗 3 遍，1% Triton X-100/PBS 于室温 15 分钟透膜；用 10% BSA/PBS室温封闭 30 分钟。去除 BSA，加入 1：100 PBS 稀释的一抗，，4℃ 湿盒内过夜。次日，PBS 3×5 分钟洗去一抗，加入 1：100 PBS 稀释罗丹明标记的荧光二抗，37℃孵箱内反应 1 小时，PBS 3×5 分钟洗去二抗，以 0.5μg/ml DAPI 处理 15 分钟标记细胞核，PBS 洗后用甘油缓冲剂封片，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。结果判定：胞核呈红色荧光的细胞为阳性细胞。阳性细胞计数：随机选取 10 个 200 倍视野进行观察计数，分别计算阳性细

状态图,小鼠胚胎干细胞,潜能,细胞形态

小鼠胚胎干细胞D3系细胞形态（bar=50μm）及多潜能状态鉴定
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

【参考文献】